2. Material und Methoden - ArchiMeD

MATERIAL UND METHODEN
Reaktionsansatzes wurde zur Transformation von kompetenten E. coli DH5α-Zellen
eingesetzt.
2.4.3 Transformation und Selektion positiver Klone
Die Transformation von Bakterien des Stammes E. coli DH5α erfolgte nach der Methode von
Hanahan (1983).
100 ml SOB-Medium wurden mit einer Übernachtkultur von DH5α angeimpft (OD550=0,05)
und unter Schütteln bei 37°C inkubiert, bis die Bakteriensuspension eine optische Dichte von
0,5 erreicht hatte. Die Zellen wurden pelletiert (1200g, 8 min, 4°C), vorsichtig in 30 ml Tbf I
resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Nach anschließender Zentrifugation (800g,
8 min, 4°C) wurden die Bakterien in 4 ml Tbf II vorsichtig resuspendiert und in 200 µl-
Aliquots bei -70°C eingefroren.
Für die Transformation wurden 50 - 100 µl dieser Bakteriensuspension mit der Hälfte des
Ligationsansatzes vermischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Die Aufnahme der Vektor-
DNA in die Bakterienzellen erfolgte durch einen 1-minütigen Hitzeschock bei 42°C. Nach
Zugabe von 1 ml SOB-Medium wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
In der Regel wurden 100 - 200 µl des Transformationsansatzes auf LB-Agarplatten mit
100 µg/ml Ampicillin, 40 µg/ml X-Gal und 50 µg/ml IPTG ausgestrichen und für 16 - 20 h
bei 37°C bebrütet.
Zur Überprüfung der Insertgröße wurde direkt aus rekombinanten Bakterienkolonien mit den
pBluescript spezifischen Primern T3A und T7A (vgl.2.15.6), wie unter 2.5 beschriebenen, eine
PCR durchgeführt.
2.4.4. Elektroporation
Die Transformation der SAGE-Konkatemere erfolgte mittels Elektroporation. Dazu wurde
1 µl der aufgereinigten Konkatemere mit 20 µl ElectroMAX DH10 (GibcoBRL, Karlsruhe)
gemischt und eine Minute auf Eis inkubiert. Der Ansatz wurde in gekühlte
Elektroporationsküvetten (0,1 cm, BioRad) überführt. Die Elektroporation erfolgte bei 2,5 Kv
und 25µF in einem Elektroporationsgerät der Firma BioRad (BioRad Gene Pulser). Der
Ansatz wurde in Transformationsröhrchen (2095, Falcon) nach Zugabe von 1 ml
vorgewärmtem SOC-Medium 1 Stunde bei 37°C geschüttelt. Es wurden jeweils 50 µl der
Suspension auf Zeocin-haltige LB-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C bebrütet.
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