2. Material und Methoden - ArchiMeD

ERGEBNISSE
fetale Maus cDNA-Bibliothek erneut hybridisiert. Es konnten fünf weitere Klone isoliert
werden (FM9 - FM13). Die Phagen-Integrate wurden mittels „Expand“-PCR mit spezifischen
Primern amplifiziert und in T-Vektor kloniert. Die Integratgröße variierte zwischen 1,5 kBp
und 2,5 kBp. Auf diese Weise konnte die Konsensussequenz auf insgesamt 5743 Bp
verlängert werden (siehe Abb. 30). Die Konsensussequenz besitzt weder ein
Polyadenylierungssignal noch eine poly(A)-Sequenz und stellt somit keine vollständige
cDNA-Sequenz dar.
Auf eine erneute Hybridisierung mit einer weiter 3´-gelegenen Sonde wurde verzichtet, da ein
Homologievergleich gegen Ende der Arbeit (Juli 1999) eine Sequenzübereinstimmung von
98% zu dem zu diesem Zeitpunkt veröffentlichten murinen Gen MINT zeigt (Newberry et al.,
1999). Ausgeschlossen von dieser Homologie war das wahrscheinlich alternativ gespleißte
Exon das durch den Klon FM3 nachgewiesen werden konnte. Auch gab es in der
Veröffentlichung keinen Hinweis auf alternativ gespleißte Exons, die in der vorliegenden
Arbeit nachgewiesen werden konnten.
Abb. 28: Sequenzierungsstrategie des murinen Klons mfc34
Eine fetale Maus cDNA-Bibliothek (Stratgene) wurde zunächst mit dem radioaktiv markierten PCR-
Produkt (Sonde 1) hybridisiert. Von acht isolierten Phagen wurden sechs vollständig sequenziert. Mit
Hilfe dieser Sequenzinformation wurde eine zweite Sonde generiert und die cDNA-Bank nochmals
untersucht. Es konnten fünf weitere Phagen isoliert und sequenziert werden. Die Sequenzen der 11
Fragmente bilden mindestens zwei mögliche Contigs, die durch RT-PCR verifiziert wurden.
Wahrscheinlich alternativ gespleißte Exons sind als Balken gekennzeichnet. Bei Anwesenheit des Exons
ist der Balken grün gezeichnet, fehlende Exons sind durch weiße Balken gekennzeichnet.
95