2. Material und Methoden - ArchiMeD

Zielsetzung
EINLEITUNG
Fortschritte bei der Aufklärung der verschiedenen genetisch bedingten Skeletterkrankungen,
aber auch das Verständnis der molekularen Vorgänge bei der Entwicklung des Skelettsystems
hängen entscheidend (1) von der weiteren Charakterisierung bekannter, im
Knorpel/Knochengewebe aktiver Gene sowie (2) von der Identifizierung neuer
Kandidatengene ab.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch unterschiedliche experimentelle Ansätze zu beiden
Bereichen beizutragen, im speziellen betraf dies:
(1) Weitere Analyse des bereits bekannten Gens FGFR3 sowie die Korrelation der Mutationen
dieses Gens mit den dadurch bedingten Krankheitsbildern, um so zusätzlichen Aufschluss
über die Funktion des Gens bei der normalen und gestörten Skelettentwicklung zu erhalten.
Durch die Aufklärung der genomischen Struktur des humanen FGFR3-Gens sollte die
Herstellung eines Sets von Primern ermöglicht werden, die zur Mutationsanalyse des
kompletten FGFR3-Gens bei Patienten mit unklaren Skelettdysplasien eingesetzt werden
sollten. Dies ermöglicht ein Mutationsscreening auf genomischer Ebene, was von großem
klinischen Interesse ist, da in den wenigsten Fällen Knorpelgewebe der Patienten zur Analyse
der FGFR3-mRNA zur Verfügung steht.
(b) Die Untersuchung der FGFR3-Spleißformen sollte zeigen, ob signifikante Unterschiede
bezüglich der zeitlichen und räumlichen Expression existieren, die Hinweise geben auf eine
bestimmte entwicklungsbiologische oder krankheitsrelevante Bedeutung.
(2) Evaluierung systematischer Ansätze zur Isolation neuer knorpelspezifischer Gene.
• In einem ersten Ansatz sollte auf der Basis einer humanen Chondrozyten-cDNA-
Bibliothek die Möglichkeit eines Knorpel-/ Knochen-EST-Projekts untersucht und
beurteilt werden. Es sollten 250 zufällig ausgewählte EST-Klone sequenziert und einer
weiterführenden Analyse unterworfen werden. Die Auswertung der Ergebnisse sollte dann
Grundlage für eine Strategie zur weiteren Auswertung der Genbank bilden.
• In einem zweiten Versuchsansatz sollte die von Velculescu et al. (1995) veröffentlichte
Methode SAGE („serial analysis of gene expression“) auf die Fragestellung der
Chondrozyten-Differenzierung angewendet und beurteilt werden. Aufgrund der sehr
aufwendigen Technologie umfasste die Zielsetzung die Etablierung der Methode
ausgehend von RNA aus einer humanen Chondrosarkom-Zelllinie und die Evaluierung
auf ihre Brauchbarkeit zur Untersuchung der oben genannten Thematik.
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