2. Material und Methoden - ArchiMeD

DISKUSSION
Mikroarray-Ansatz anschließen soll. Ob für dieses Sequenzierprojekt eine Strategie
durchgeführt werden soll, mit der ubiquitär exprimierte Gene eliminiert werden, ist in
Anbetracht der zunehmenden Automatisierung der Sequenzierung fraglich.
4.3.3 Detaillierte Analyse des Klons Efc34
Der in der vorliegenden Arbeit charakterisierte murine EST Klone Efc34 ist identisch mit
einer cDNA (MINT) die von Newberry et al. (1999) publiziert wurde. Bei der Suche nach
Interaktionspartnern von Msx-2 konnte das MINT-Gen (Msx-2 interacting nuclear target)
identifiziert werden. Durch Northern-Blot Analyse konnte die Expression in Hoden sowie in
Osteoblasten und Gehirn nachgewiesen werden. Die MINT-cDNA codiert für ein Protein von
3576 Aminosäuren. Die Proteinsequenz-Analyse zeigt das Vorliegen von drei N-terminalen
RNA-Erkennungsmotiven (RRM) und vier nukleären Lokalisationssignalen (NLS), inklusive
einer Msx-2 Bindedomäne (Newberry et al., 1999). Die cDNA-Sequenz von Efc34 wurde
aufgrund des Vorliegens der publizierten MINT-Sequenz nicht vervollständigt. Der Vergleich
der ermittelten Efc34 Sequenz mit der MINT-cDNA zeigte einige Unterschiede. So konnte in
der vorliegenden Arbeit der Nachweis mehrerer alternativ gespleißter Exons erbracht werden
(Abb. 29). Während das alternative Spleißen von einem 99 Bp- bzw. einem 69 Bp-Exons
keinen vorzeitigen Abbruch des offenen Leserahmens zur Folge hat, wird bei Anwesenheit
eines 5´-gelegenen 1208 Bp-Exons der Translationsstart zerstört. Ein möglicher, weiter
stromabwärts gelegener Translationsstartpunkt zeigt jedoch keine Übereinstimmung zu der
von Kozak (1987) formulierten Consensussequenz für Translationsstarts. Bei der Nutzung
diese Translationsstarts wäre das mögliche Protein um das erste RNA-Erkennungsmotiv
verkürzt. Der Nachweis zweier unterschiedlich großer Transkripte in Northern-Blot Analyse
mit Größen von 12 kBp und 4,6 kBp bestätigen das Vorliegen mehrerer Varianten (Abb. 31).
Newberry et al. (1999) zeigten, dass das reife MINT-Protein in ein N-terminales 110 kDa
Fragment und ein C-terminales 250 kDa Fragment gespalten wird. Beide Fragmente konnten
im Chromatin nachgewiesen werden. Das 110 kDa Fragment erkennt und reguliert über die
drei RRM-Domänen den Osteocalcin-Promotor. Jedes RNA-Erkennungsmotiv setzt sich aus
90 bis 100 Aminosäuren zusammen. Das Motiv kann in einfacher oder in tandemartiger
Anordnung in dem Protein vorkommen (Burd und Dreyfuss, 1994). Im Fall des MINT-Protein
konnte gezeigt werden, dass es ähnlich wie andere Transkriptionsfaktoren (z. B. hTAFII68,
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