2. Material und Methoden - ArchiMeD

MATERIAL UND METHODEN
2.11.6 Abtrennen der cDNA von Streptavidin Beads durch Restriktion mit dem Enzym
BsmF1
Durch einstündige Restriktion bei 65°C mit BsmF1 (NEB, Bad Schwalbach) wurde der 5´-
Bereich der cDNA von den magnetischen Kügelchen abgeschnitten und durch Inkubation in
dem magnetischen Partikeltrenner (Dynal, Oslo, Norwegen) von dem noch an die Kugeln
gebundenen 3´-Bereich abgetrennt. Der Ansatz wurde Phenol/Chloroform aufgereinigt und
anschließend Ethanol gefällt.
2.11.7 Herstellen von glatten Enden und Ligation zur Herstellung von Ditags
Zum Auffüllen der durch die BsmF I-Restrikion entstandenen überhängenden Enden wurde
Klenow Enzym (Pharmacia, Freiburg) benutzt.
Dazu wurden die zwei cDNA-Ansätze getrennt jeweils mit 1x Zweitstrangpuffer (cDNA-
Synthese Kit, GibcoBRL, Karlsruhe), 2x BSA, 500 µM dNTPs und 3 U Klenow Enzym
(Pharmacia, Freiburg) versetzt und 30 min bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurden die
Ansätze mit Phenol/Chloroform aufgereinigt und einer Ethanolfällung unterworfen. Die
gewaschenen, getrockneten Pellets wurden in jeweils 6 µl LoTE-Puffer resuspendiert.
Im folgenden Schritt wurden die beiden Fragmente mit den stumpfen Enden durch Inkubation
bei 16°C über Nacht ligiert. Hierfür wurde eine hochkonzentrierte T4-Ligase (5U/µl)
(GibcoBRL, Karlsruhe) verwendet. Durch Zugabe von 14 µl LoTE-Puffer wurde die Ligation
nach 20 h abgebrochen, es erfolgte sofort im Anschluß eine PCR-Amplifikation der Ditags.
2.11.8 PCR-Amplifikation und Aufreinigung der Ditags
Im Anschluß an die Ligation wurde das Reaktionsvolumen mit 14 µl LoTE-Puffer auf 20 µl
aufgefüllt. Es wurde eine Verdünnungsreihe angesetzt, wobei 1 µl als template in der
anschließenden PCR-Reaktion diente. Der PCR-Ansatz setzte sich aus 16,6 mM (NH4)2SO4;
67 mM Tris pH 8,8; 6,7 mM MgCl2; 10 mM β-Mercaptoethanol; 6% DMSO; 1,5 mM dNTPs,
350 ng von beiden internen SAGE-Primern und 5 U der AmpliTaq Gold (Perkin Elmer)
zusammen. Es wurde grundsätzlich ein „hotstart“ durchgeführt. Der PCR-Ansatz durchlief 28
Zyklen, mit 30 Sekunden Denaturierung bei 95°C, 30 Sekunden Anlagerung der Primer bei
30