2. Material und Methoden - ArchiMeD

MATERIAL UND METHODEN
2.9.1 In-vivo-Exzision von pBluescript aus λ ZapII mit Hilfe des ExAssist TM /SOLR TM
Systems
Der Uni-ZAP-Vektor ist so konstruiert, dass einklonierte DNA-Integrate in vivo
ausgeschnitten und rezirkularisiert werden können, ohne dass weitere Subklonierungsschritte
durchgeführt werden müssen.
Hierzu wurden 100 µl der im SM-Medium befindlichen positiven Klone mit 200 µl XL1-
Blue-Zellen (OD600=1,0) und 1 µl ExAssist Helferphagen (>1x 10 6 pfu/ml) für 15 min bei
37°C inkubiert. Nach Zugabe von 3 ml 2x YT-Medium wurde der Ansatz bis zur Ausbildung
eines klaren Lysats für 3,5 – 4 h bei 37°C geschüttelt. Zum Abtöten der Bakterien wurde der
Ansatz 20 min auf 70°C erhitzt, es folgte eine 15-minütige Zentrifugation bei
4000 g. 1 µl des Überstandes wurden mit 200 µl SOLR-Zellen (OD600=1,0) für 15 min bei
37°C inkubiert. Anschließend wurden 100 µl des Ansatzes auf LB-Ampicillin Platten (50
µg/ml) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
2.10 Tierhaltung und Präparation von Mausembryonen
H/H-Mäuse wurden unter standardisierten Bedingungen bei 22°C Raumtemperatur, einer
Luftfeuchtigkeit von 55 ± 10% und einem Hell-Dunkelzyklus von 12 Stunden gehalten. Die
Tiere erhielten Standardfutter und Wasser ad libitum. Um schwangere Weibchen zu erhalten,
wurden 6 - 8 Wochen alte H/H Weibchen über Nacht mit H/H Männchen verpaart. Der Tag,
an dem ein Vaginalpfropf auftrat, wurde als Tag 0,5 der Schwangerschaft gezählt. Die
Versuchstiere wurden zwischen 11 und 13 Uhr getötet und frei von Embryonalhüllen
präpariert. Für die radioaktive in situ-Hybridisierung wurden die Embryonen auf einem
Kupferstück auf Trockeneis eingefroren und bei -80°C gelagert.
Zur Isolierung von RNA aus Embryonen wurden diese in Flüssigstickstoff gefroren und bis
zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert.
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