2. Material und Methoden - ArchiMeD

2.14.2 Protein-Extraktion
MATERIAL UND METHODEN
Zur Isolierung von Proteinextrakt wurden die Zellen nach Abgießen des Kulturmediums mit
5 ml eiskaltem PBS-Puffer gespült. Pro 75 cm 2 -Kulturflasche wurde 1 ml Extraktions-
puffer A pipettiert und 10 min auf Eis unter gelegentlicher Bewegung inkubiert. Der Zellrasen
wurde dann mit einem Gummiwischer abgeschabt und die lysierte Zellsuspension bei
14000 Upm für 10 min in einer Kühlzentrifuge (4°C) zentrifugiert. Der Überstand, der
hauptsächlich die Proteine des Cytosols und der Cytomembran enthält, wurde bis zur
gelelektrophoretischen Auftrennung bei –80°C gelagert.
2.14.3 SDS-Gelelektrophorese
Mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist es möglich, Proteine aufgrund ihrer
relativen Molekülmasse zu trennen (Laemmli, U. K., 1970). Natriumdodecylsulfat (SDS)
lagert sich an hydrophobe Bereiche der Proteine an, wodurch eine Entfaltung der Proteine und
gleichzeitig eine Einführung negativer Ladungen bewirkt wird. Dadurch wird die Eigenladung
der Proteinmoleküle vernachlässigbar. Die Konsequenz ist, dass weder die native Form noch
die Ladung der aufzutrennenden Proteine bei der Wanderung durch die Gelmatrix ins Gewicht
fällt und es durch den Molekularsiebeffekt der Gelmatrix zur Auftrennung der Proteine nach
der relativen Molekülmasse kommt.
Zunächst wurde ein 7,5%-iges Trenngel gegossen und mit H2O-gesättigtem Butanol
überschichtet. Nach Polymerisation wurde das Butanol abgekippt, das Sammelgel auf das
Trenngel gegossen und der Probenkamm eingesetzt. Die Proteinproben wurden mit 6x SDS-
Probenpuffer versetzt und 4 min bei 100°C denaturiert. Als Längenstandard dienten 6 µl
„Prestainded Protein Marker Broad Range“ (NEB, Bad Schwalbach), der ebenfalls denaturiert
wurde. Die Elektrophorese erfolgte bei Raumtemperatur in einer Minigelapparatur bei 15 mA
für 3 - 4 Stunden.
Trenngel (7,5% PAA): 3,75 ml 30% PAA (30:0,8)
3,75 ml 4xTris Cl/SDS ph 8,8
7,5 ml H2O
50 µl 10% APS
10 ml TEMED
Sammelgel (3,9% PAA): 650 µl PAA (30:0,8)
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