2. Material und Methoden - ArchiMeD

2.8. Hybridisierungstechniken
2.8.1 DNA-DNA-Hybridisierung nach Southern
MATERIAL UND METHODEN
Elektrophoretisch aufgetrennte DNA-Fragmente wurden mittels Southern-Transfer (Southern,
1975) aus Agarosegelen auf Nylonmembranen (Hybond TM N + , Amersham) übertragen. Die
Agarosegele wurden zunächst für 30 min in Denaturierungspuffer und anschließend für 45
min in Neutralisierungspuffer inkubiert. Als Transferpuffer diente 10x SSC. Der Transfer
erfolgte über Nacht (16 - 20 h). Danach wurde die Nylonmembran kurz in 2x SSC gewaschen
und für 2 h bei 80°C im Ofen zur Fixierung der DNA gebacken.
Die Prähybridisierung erfolgte bei 65°C für mindestens 4 h in “Church”-
Hybridisierungspuffer. Die Hybridisierung der DNA mit der denaturierten radioaktiven Sonde
(vgl. 2.7.1) in einer Konzentration von 5x10 5 bis 1x10 6 cpm pro ml Hybridisierungspuffer
wurde bei 65°C für 16 - 20 h durchgeführt. Im Anschluß wurden die Filter bei 65°C mit
zunehmender Stringenz in NaHPO4 - - Puffer, 1% SDS gewaschen, bis die auf einem Müller-
Geiger-Zähler gemessene Aktivität zwischen 20 und 50 Zerfälle/Sekunde lag.
Zur Autoradiographie wurden die noch feuchten Filter mit einem Röntgenfilm (RPN8,
Amersham) bedeckt und in einer mit Verstärkerfolie (Quanta III, Cronex-Kassette, DuPont)
ausgekleideten Filmkassette exponiert. Die Exposition der Filme erfolgte bei -80°C für 3 bis
48 h.
2.8.2 RNA-DNA Hybridisierung
Für die Northern-Hybridisierung wurden ungefähr 15 µg Gesamt-RNA auf einem 1%-igen
Agarosegel (vgl. 2.3.2) elektrophoretisch aufgetrennt. Im Anschluß wurde das Gel 40 min in
Hydrolyse-Puffer (50 mM NaOH / 10 mM NaCl), danach zweimal 20 min in
Neutralisierungs-Puffer (0,2 M Tris pH 7,4/ 10x SSC) inkubiert. Durch diesen Schritt wird die
RNA in kleinere Fragmente zerlegt, was einen effektiveren Transfer zur Folge hat. Die RNA
wurde danach über Nacht mit 10x SSC als Transferpuffer auf Hybond-N + (Amersham,
Brauschweig) transferiert. Die Fixierung erfolgte durch UV-Licht in einem Stratalinker-Gerät
(Stratagene, Amsterdam). Die weitere Behandlung des Filters erfolgte wie unter 2.8.1
beschrieben.
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