2. Material und Methoden - ArchiMeD

MATERIAL UND METHODEN
murinen Schnitte wurden mit 50 – 100 µl Hybridisierungslösung bedeckt und für 16 Stunden
in einer feuchten Kammer (4x SSC, 50% Formamid) bei 42 °C inkubiert.
Zur Entfernung überschüssiger Sonde wurden die Objektträger 4x in 1xSSC bei 55 °C für
jeweils 15 min gewaschen. Die Schnitte wurden in einer aufsteigenden Alkoholreihe
getrocknet, anschließend wurde eine Exposition auf Amersham Hyperfilm-β-max
durchgeführt. Der Film wurde zwischen 5 - 8 Tagen exponiert. Das entwickelte
Autoradiogramm erlaubte die grobe Lokalisation der Expression in verschiedenen
Embryobereichen. Darüber hinaus zeigten die Kontrollen, ob das Oligonukleotid spezifisch
hybridisiert hatte.
Der Nachweis der radioaktiv markierten Sonde erfolgte durch Autoradiographie. Dabei
wurden die Objektträger mit einer strahlungssensitiven Emulsion (NTB2, Kodak) beschichtet.
Die Schwärzung des Autoradiogramms entsteht durch Wechselwirkung von Atomen in der
Photoemulsion mit ß-Strahlern des an das Oligonukleotids gekoppelten Isotops. Die Emulsion
enthält Silberhalogenide, die durch die Energie der Wechselwirkungen zu metallischem Silber
reduziert werden. Die Silberatome aggregieren zu größeren, mikroskopisch sichtbaren
Silberkörnern. Dieses latente Bild kann mit normalen photographischen Methoden entwickelt
und fixiert werden.
Bei der Durchführung war vor allem darauf zu achten, daß alle Schritte in absoluter
Dunkelheit stattfanden. Da das Auflösungsvermögen mit der Schichtdicke der Emulsion
abnimmt, wurde diese, 1:1 mit Wasser verdünnt, bei 37°C geschmolzen. Die Objektträger
wurden kurz in die luftblasenfreie Emulsion getaucht und über Nacht in vertikaler Position
getrocknet.
Die getrockneten Schnitte wurden in lichtdichten Kunststoffbehältern mit einem
Trocknungsmittel (Silikagel) bei Raumtemperatur 3 bis 4 Wochen exponiert.
Die mit Emulsion beschichteten Objektträger wurden 5 min in D19 Entwickler (Kodak)
entwickelt, kurz in H2O gewaschen und dann 6 min in Kodak 3000 A Fixierer fixiert. Nach
einstündigem Waschen mit Leitungswasser wurden die Schnitte einmal mit bidestilliertem
Wasser gewaschen und anschließend luftgetrocknet.
Die mikroskopische Auswertung der Objektträger erfolgte an einem Axiophot Mikroskop
(Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland). Als Filmmaterial wurden S/W-Filme TMX 100
(Kodak) verwendet.
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