2. Material und Methoden - ArchiMeD

2. Material und Methoden
2.1 Isolierung von DNA
2.1.1 Isolierung von genomischer DNA aus Blut
MATERIAL UND METHODEN
Die Isolierung von genomischer DNA aus Blut erfolgte mit Hilfe von Qiagen-tip 100 Säulen
(Qiagen, Hilden) entsprechend den Angaben des Herstellers.
5 ml Vollblut wurden mit 20 ml eiskaltem Puffer G1 vermischt und 10 min auf Eis inkubiert.
Nach Zentrifugation bei 1300 g für 15 min (4°C) wurde das Pellet in 5 ml eiskaltem PBS-
Puffer resuspendiert und erneut unter sonst gleichen Bedingungen zentrifugiert. Nach
Resuspension des Pellets in Puffer G2 wurden 150 µl Proteinase K Lösung (20 mg/ml)
zugesetzt und bei 50°C für 1 h inkubiert. Die nun klare Lösung wurde dann auf eine mit
Puffer QBT äquilibrierte Qiagen-tip 100 Säule aufgetragen und mit 10 ml Puffer QC
gewaschen. Die DNA wurde mit 5 ml Puffer QF von der Säule eluiert. Nach
Isopropanolfällung und Waschen der DNA mit 70% Ethanol konnten zwischen 80 und 100 µg
DNA isoliert werden.
2.1.2 Isolierung von DNA für die Plasmidsequenzierung
Die Präparation von Plasmid-DNA für die Sequenzierung mit dem automatischen DNA-
Sequenzierer 373A bzw. 377 der Firma Applied Biosystems (Weiterstadt) erfolgte mit Hilfe
des “RPM Sample Kits” (Dianova, Hamburg) entsprechend den Herstellerangaben.
Ausgegangen wurde von 3 ml einer Bakterien-Übernachtkultur. Das Reinigungsprinzip beruht
darauf, daß nach alkalischer Lyse (Birnboim und Doly, 1979) die Plasmid-DNA an Glasmilch
gebunden wird. Grundsätzlich wurde die DNA in zwei Waschschritten mit Waschpuffer
gereinigt, mit 50µl H2O eluiert, mit Ethanol gefällt, gewaschen und in 10 µl H2O
aufgenommen. Zur Abschätzung der DNA-Konzentration wurde 1 µl der DNA-Lösung auf
einem 1 % Agarosegel aufgetragen.
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