2. Material und Methoden - ArchiMeD

102 Bp
1/5
1/10
1/50
1/100
1/200
M1
H 2 O
(A) Optimierung der Ditag PCR
Linker
~40 Bp
Linker
Ditag
125
100
(A) Ditag PCR im großen Maßstab
102 Bp
(B) Isolierung von Ditags (C) Konkatemerisierung von Ditags
50
Bp
ERGEBNISSE
Abb. 35: “SYBR-Green”-gefärbte Polyacrylamid-Gele [Bei (A) und (B) 12%, bei (C) 8%] mit Beispielen
verschiedener Schritte der SAGE-Methode.
(A) Jeweils 1 µl unterschiedlicher Verdünnungen (1/5, 1/10, 1/50, 1/100, 1/200) der ligierten „Tags“ dienten als
Matrize zur Amplifikation der „Ditags“ (28 Zyklen). Deutlich ist neben mehreren Hintergrund-Banden, eine
102 Bp-Bande, die den amplifizierten „Ditags“ entspricht, zu erkennen. Nach Optimierung der PCR-
Bedingungen wurde von der 1/50 Verdünnung die „Ditag“-PCR im 96-Lochformat durchgeführt. Die PCR-
Produkte wurden vereinigt, gefällt und auf einem präparativen Gel aufgetrennt. Die 102 Bp-Bande wurde
ausgeschnitten und aufgereinigt.
(B) Nach Restriktion mit NlaIII zum Abtrennen der Linker-Anteile, wurde der Ansatz gelelektrophoretisch
aufgetrennt und die 22-26 Bp große „Ditag“-Bande ausgeschnitten und aufgereinigt.
(C) Die isolierten „Ditag“ wurden konkatemerisiert und gelelektrophoretisch aufgetrennt.Es wurden drei
Bereiche unterschiedlicher Größe aus dem Gel ausgeschnitten, aufgereinigt und in pZero-Vektor kloniert.
M1 25 Bp-Leiter, M2 20 Bp-Leiter, M3 100 Bp-Leiter.
M1
Linker Ditag Linker
~40 Bp
Ditag
~22 Bp
~ 22 Bp
Linker
~ 40 Bp
~ 40 Bp
M2 M3
Fraktion 1
Fraktion 2
Fraktion 3
Ditag Ditag Ditag Ditag
107