2. Material und Methoden - ArchiMeD

DISKUSSION
nachfolgende Amplifikation und Restriktion (z. B. mit BsmFI) der Pools 13-20 Bp lange
Fragmente entstehen, die sich aus einem Linkeranteil sowie einer spezifischen cDNA-
Sequenz zusammensetzen. Nach anschließender Konkatemerisierung und Klonierung dieser
Fragmente kann pro Sequenzreaktion ein Satz von bis zu 20 verschiedenen „Tags“
sequenziert werden, wobei jedes „Tag“ ein Transkript repräsentiert. Dadurch kann mit einem
geringen Sequenzieraufwand eine Vielzahl von Transkripten analysiert werden. Die relative
Häufigkeit der untersuchten Gene (und somit ihre Expressionsstärke) kann durch Auszählen
der sequenzierten “Tags” ermittelt werden. Wesentlicher Vorteil der SAGE-Methode ist, dass
eine sehr große Anzahl an Transkripten untersucht werden kann und, dass nach Herstellung
mehrerer verschiedener SAGE-Bibliotheken das Expressionsprofil der verschiedenen
untersuchten Gewebe bzw. Zellkulturen verglichen werden kann. Zur Auswertung der
gewonnenen Sequenzdaten ist allerdings eine spezielle Computer-Software notwendig. Des
Weiteren ist, wie auch bei allen anderen beschriebenen Methoden, die Qualität der RNA von
wesentlicher Bedeutung. So können geringste Spuren von genomischer Verunreinigung zu
irreführenden Artefakten führen.
In Tabelle 14 sind einige Merkmale und Bedingungen der Techniken aufgelistet, die bei der
Auswahl der durchzuführenden Methoden zu beachten sind. Eine Schwierigkeit der
Hochdurchsatz-Methoden ist es, relevante Gene aus den gewonnenen Daten zu erkennen und
weiter zu analysieren. Die genaue bioinformatische Auswertung der gewonnenen Ergebnisse
kann entscheidend dazu beitragen, relevante Gene für die jeweilige Fragestellung zu finden.
Auch kann die Untersuchung zahlreicher verschiedener Proben und die weitere Bearbeitung
nur der Gene, die bei unterschiedlichen Versuchsansätzen ein auffälliges Ergebnis zeigen, bei
der Identifizierung relevanter Gene helfen. Von Bedeutung ist auch das Leistungsvermögen
des jeweiligen Labors, so ist die Durchführung eines EST- bzw. SAGE-Projekt nur bei
ausreichender Sequenzierkapazität möglich. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgte die
Evaluierung eines EST- und eines SAGE-Projektes unter Berücksichtigung der Knorpel-
/Knochenentwicklung.
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