2. Material und Methoden - ArchiMeD

3.3.1 Herstellung einer Chondrosarkom-SAGE-Bank
ERGEBNISSE
Zur Etablierung der Methode wurde einfach zu isolierende und in großen Mengen verfügbare
RNA einer Chondrosarkom-Zell-Linie (ATCC Nummer HTB-94) verwendet. Chondro-
sarkome (Knorpelsarkom) sind neben Osteosarkomen die zweithäufigst vorkommenden
malignen Knochentumore, die sich aus embryonalen oder ausgereiftem knorpeligem Gewebe
entwickelt (Pschyrembel, 1994). Die Herstellung der SAGE-Bank diente neben der
Etablierung der Methode auch der Charakterisierung der Zell-Linie, die als Referenz für das
durchgeführte Knorpel-EST-Projekt herangezogen werden kann.
Aus 540 µg Gesamt-RNA wurde mit Hilfe des Oligotex-mRNA-Kits (Qiagen, Hilden) 5,8 µg
mRNA isoliert, die als Ausgangsmaterial für eine cDNA-Synthese diente. Mit Hilfe von
biotinyliertem Oligo-d(T)-Primer konnten 3,4 µg doppelsträngige, biotinylierte cDNA
hergestellt werden. Nach Restriktion mit NlaIII wurde der Ansatz halbiert und es erfolgte die
Kopplung der am meisten 3´-gelegenen Restriktionsfragmente über die biotinylierte oligo-dT-
Sequenz an magnetische Streptavidin-Kügelchen. Durch Bindung der Streptavidin-Kügelchen
an den magnetischen Partikeltrenner (Dynal, Oslo, Norwegen) konnten die am meisten 3´-
gelegenen Restriktionsfragmente von den 5´-Bereich jedes Transkript abgetrennt werden.
Sofort im Anschluss erfolgte die Ligation des doppelsträngigen Linker an das 3´-gelegene
Fragment. Die Herstellung der doppelsträngigen Linker erfolgte aus einzelsträngigen
Oligonukleotiden und ist unter 2.11.4 genau beschrieben. Die Linkersequenz ist so
konstruiert, dass eine Typ-II-Restriktionserkennungssequenz innerhalb des Linkers liegt.
Durch Restriktion mit dem Typ-II-Restriktionsenzym BsmFI wird der Linker einschließlich
10-11 Bp der cDNA abgeschnitten. Die „Linker/Tag“-Konstrukte können von den an den
magnetischen Partikeltrenner gekoppelten 3´-Fragmenten einfach getrennt und weiter
bearbeitet werden. Vor der Ligation der „Tags“ wurden die durch die BsmFI-Restriktion
entstandenen überstehenden Enden mit Klenow-Enzym aufgefüllt. Die Ligation der
„Linker/Tag“-Fragmente über die Linkerenden sollte durch eine Modifikation der Linker an
ihren 3´-Enden verhindert werden. Der Ligationsansatz stellt dann das Template für die
anschließende PCR-Reaktion dar.
Nach Amplifikation der „Ditags“ mit Linker-spezifischen Primern war eine 102 Bp-Bande,
bestehend aus zwei Linkern (≈ 40 Bp) und einem „Ditag“ (≈ 22 Bp), zu erwarten. Wie in Abb.
35A dargestellt konnte mit einer 1/50 Verdünnung der ligierten „Tags“ als Template in der
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