2. Material und Methoden - ArchiMeD
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XXXXXXXXXX TTTTT<br />
XXXXXXXXXX AAAAA<br />
XXXXXXXXXX AAAAA<br />
GTACXXXXXXXXXX TTTTT<br />
XXXXXXXXXX TTTTT<br />
GTACXXXXXXXXXX AAAAA<br />
XXXXXXXXXX AAAAA<br />
Primer 1 GTACXXXXXXXXXX TTTTT<br />
CATG XXXXXXXXXX AAAAA<br />
Primer 1 GTACXXXXXXXXXX TTTTT<br />
CATG<br />
Primer 1 CATG<br />
XXXXXXXXXX TTTTT<br />
Primer 1 GTACXXXXXXXXXX AAAAA<br />
CATGXXXXXXXXXX<br />
TTTTT<br />
Primer 1 GTACXXXXXXXXXX AAAAA<br />
CATG<br />
Primer 1 CATG<br />
TE AE TAG<br />
XXXXXXXXXX<br />
Primer 1 GTACXXXXXXXXXX<br />
CATG XXXXXXXXXX<br />
Primer 1 GTACXXXXXXXXXX<br />
CATG<br />
Primer 1 CATG<br />
TE AE TAG<br />
XXXXXXXXXX<br />
Primer 1<br />
GTACXXXXXXXXXX<br />
CATGXXXXXXXXXX<br />
Primer 1<br />
GTACXXXXXXXXXX<br />
CATGXXXXXXXXXX<br />
Primer 1<br />
GTACXXXXXXXXXX<br />
CATG<br />
Primer 1 CATG<br />
XXXXXXXXXX AAAAA<br />
XXXXXXXXXX TTTTT<br />
AAAAAA<br />
AAAAAA<br />
AAAAA<br />
TTTTT<br />
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCATG<br />
Primer Primer 1 1CATG GTACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTAC Primer 2<br />
CATG<br />
TAG TAG<br />
DITAG<br />
DITAG<br />
AAAAAA<br />
---TTTTT XXXXXXXXXX<br />
AAAAA XXXXXXXXXX<br />
AAAAA<br />
TTTTT<br />
TTTTT<br />
AAAAA<br />
AAAAAA<br />
XXXXXXXXXX<br />
XXXXXXXXXX<br />
XXXXXXXXXXCATG<br />
XXXXXXXXXXGTAC Primer Primer 2<br />
XXXXXXXXXXCATG<br />
XXXXXXXXXXGTAC Primer 2<br />
TAG AE TE<br />
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCATG<br />
Primer 1CATG 1 GTACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTAC Primer 2<br />
CATG<br />
GTACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCATG<br />
GTACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTAC<br />
DITAG DITAG<br />
XXXXXXXXXXCATG<br />
XXXXXXXXXX<br />
XXXXXXXXXXCATG<br />
XXXXXXXXXX<br />
AAAAA<br />
TTTTT<br />
TTTTT<br />
AAAAA<br />
ERGEBNISSE<br />
Reverse Transkription mit<br />
biotinylierten Oligo(dT)-Primern<br />
Verdau mit Ankerenzym (AE)<br />
Koppeln an Streptavidin Beads<br />
Aufteilung der Ansätze<br />
Ligation der Linker 1 <strong>und</strong> 2<br />
XXXXXXXXXXCATG<br />
XXXXXXXXXXGTAC<br />
Primer 2<br />
XXXXXXXXXXCATG<br />
XXXXXXXXXXGTAC Primer Primer 2<br />
Verdau mit Tagging Enzym (TE)<br />
Herstellung von glatten Enden<br />
Ligation<br />
Amplifikation mit Primer 1 <strong>und</strong> 2<br />
Verdau mit Ankerenzym (AE)<br />
Isolierung der Ditags<br />
Konkatemerisierung<br />
Klonierung<br />
Abb. 34: Graphische Darstellung der SAGE-Methode (Velculescu et al., 1995).<br />
mRNA wird mit einem biotinyliertem Oligo-(dT)-Primer revers transkribiert. Durch Bindung an<br />
Streptavidin-Kügelchen <strong>und</strong> anschließender Restriktion mit dem Ankerenzym (NlaIII) wird das am<br />
meisten 3´-gelegene Restriktionsfragment jedes Transkript isoliert. Der Ansatz wird halbiert <strong>und</strong> es<br />
werden zwei spezifische Linker kovalent geb<strong>und</strong>en. Jeder Linker besitzt eine Typ-II-Restriktionserkennungssequenz.<br />
Nach Restriktion mit dem „Tagging“ Enzym (BsmFI) entsteht ein Konstrukt aus<br />
Linkersequenz <strong>und</strong> kurzer Sequenzabfolge der cDNA („Tag“). Nach Herstellung von glatten Enden,<br />
werden die beiden Ansätze wieder vereinigt <strong>und</strong> die „Tags“ werden ligiert. Die entstandenen „Ditags“<br />
werden amplifiziert. Durch Restriktion mit dem Ankerenzym (NlaIII) werden die Linkeranteile<br />
abgetrennt. Nach Konkatemerisierung der „Ditags“ werden diese in einen geeigneten Vektor kloniert<br />
<strong>und</strong> sequenziert.<br />
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