2. Material und Methoden - ArchiMeD

ERGEBNISSE
Die Auswertung der bereits sequenzierten EST-Klone zeigte, dass einige cDNA-Sequenzen
besonders häufig in der Chondrozyten-spezifischen cDNA-Bibliothek vertreten sind. Dazu
zählen ESTs die Teilen der Typ II Kollagen-, der Ferritin-, der Ubiquitin- bzw. der
Elongations Faktor 1-cDNA entsprechen. Von den veröffentlichten cDNA-Sequenzen dieser
vier Gene wurden spezifische Primer abgeleitet. Durch RT-PCR mit humaner
Chondrosarkoma-cDNA als Template konnten genspezifische Sonden hergestellt werden,
welche nach Aufreinigung radioaktiv markiert werden konnten (Abb. 22).
Des Weiteren zeigte sich, dass ribosomale Proteine besonders häufig in der cDNA-Bank
vertreten sind. Von 253 ansequenzierten Klonen zeigen 53 Homologie zu ribosomalen
Proteinen. 11 Klone (Efc2, Efc3, Efc23, Efc26, Efc33, Efc50, Efc73, Efc87, Efc115, Efc142,
Efc158) wurden durch in-vivo Exzision in ein bakterielles System überführt (siehe 2.9.1). Von
der präparierten DNA wurde durch EcoR1/ Xho1-Restriktion die Linkersequenzen abgetrennt
und anschließend über ein Agarosegel aufgereinigt. Diese Fragmente wurden ebenfalls
radioaktiv markiert.
Abb. 22: Herstellung spezifischer Sonden
Gelelektrophoretische Auftrennung der aufgereinigten PCR-Produkte, die als Sonden eingesetzt wurden.
(1) Elongations Faktor 1, (2) Ferritin, (3) und (4) Kollagen Typ II und (5) Ubiquitin. Als
Molekulargewichtsstandard (M) wurde eine 100 Bp “Leiter” verwendet. Die gelelektrophoretische
Auftrennung erfolgte auf einem 1,2% Agarosegel.
Insgesamt wurden ungefähr 3000 rekombinante Phagen-Klone auf Filter überführt und mit
dem beschriebenen, radioaktiv markierten Sondengemisch hybridisiert. 480 Phagen, die weder
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