2. Material und Methoden - ArchiMeD

2.4 Subklonierung von DNA-Fragmenten in Plasmid-Vektoren
MATERIAL UND METHODEN
Zur Subklonierung von DNA-Fragmenten wurde der Plasmidvektor pBluescript ® II SK +
(Stratagene, Heidelberg) mit dem entsprechendem Restriktionsenzym verdaut und je nach
Bedarf mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (Boehringer, Mannheim) behandelt.
Sowohl die Vektor-DNA als auch die subzuklonierenden Fragmente wurden über ein
Agarosegel aufgereinigt (siehe 2.3.3).
2.4.1 Klonierung von PCR-Fragmenten in den modifizierten Vektor pBluescipt II SK +
(T-Vektor)
Zur effektiven Klonierung von PCR-Produkten wurde der linearisierte Vektor pBluescript
nach der Methode von Marchuk et al. (1990) an seinen Enden modifiziert.
Die Taq-Polymerase hat die Eigenschaft template-unabhängig an das 3`-Ende von PCR-
Produkten ein Desoxyadenosin zu heften. Diese Tatsache wurde ausgenutzt und der Vektor
wurde nach Restriktion dem sogenannten „T-Tailing“ unterworfen.
Für die Herstellung wurden 3 µg pBluescript mit dem Restriktionsenzym EcoRV verdaut und
am 3´-Ende ein Desoxythymidin (dTTP) angefügt. Die Reaktion erfolgte in einem Ansatz
bestehend aus 50 mM KCl, 10 mM Tris (pH 8.3), 0,1 % Gelatine, 1,5 mM MgCl2, 4,75 mM
dTTP und 5 Units Taq-Polymerase für 1 Stunde bei 75°C. Nach Gelaufreinigung wurde der
T-Vektor in ¼ TE-Puffer gelöst und zur direkten Klonierung von PCR-Fragmenten
verwendet.
2.4.2 Ligation
Die Ligationsreaktion erfolgte mit Hilfe von T4 DNA Ligase (New England Biolabs,
Schwalbach) in dem vom Enzymhersteller empfohlenen Puffer. In der Regel variierte die
Menge an eingesetzter Vektor-DNA und einzuklonierender DNA zwischen 50 und 100 ng. Es
wurde in einem Reaktionsvolumen von 15 µl über Nacht bei 16°C ligiert. Die Hälfte dieses
18