2. Material und Methoden - ArchiMeD

ERGEBNISSE
durchgeführten PCR eine deutliche 102 Bp Bande generiert werden. Insgesamt wurden 5x 96
PCRs durchgeführt, vereinigt und über ein Polyacrylamidgel aufgereinigt. Die isolierte 102
Bp Bande wurde nicht quantifiziert. Die Abtrennung der Linkersequenzen von den „Ditags“
erfolgte durch Restriktion mit NlaIII und anschließender Auftrennung auf einem
Polyacrylamidgel. Die 22-26 Bp großen „Ditag“-Banden wurden so von den 40 Bp großen
Linkers, sowie von ungeschnitten „Linker-Ditag“ Anteilen getrennt (Abb. 35B). Nach
Konkatemerisierung der „Ditags“ war ein Gemisch aus unterschiedlich langen Fragmenten zu
erwarten. Einer weiteren Sequenzierung sollten nur die Fragmente unterworfen werden, die
aus möglichst vielen aneinandergereihten „Ditags“ bestehen. Aus diesem Grund wurden die
konkatemerisierten „Ditags“ auf einem 8%igem Polyacrylamidgel gelelektrophoretisch
aufgetrennt. Es wurden drei Fraktionen unterschiedlicher Größe aus dem Gel ausgeschnitten
(Abb. 35B), aus dem Gel eluiert und in pZero-Vektor kloniert. Die Transformation lieferte aus
der ersten Fraktion 1750 Kolonien, aus Fraktion 2 2800 und Fraktion 3 2750 Kolonien.
PCR-Analyse mit vektorspezifischen M13F/M13R-Primern zeigte, daß ungefähr 50% der
Fraktion-1-Kolonien ein Insert besaßen, wobei die Insertgröße zwischen 500 und 700 Bp
variierte. Ungefähr 75% der Fraktion-2-Kolonien besaßen ein Insert mit einer Integratgröße
von 250-500 Bp, während bei Kolonien der Fraktion 3 keine Integrate nachweisbar waren.
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