2. Material und Methoden - ArchiMeD

DISKUSSION
Geweben bzw. Zellen in cDNA umgeschrieben, amplifiziert, auf einem Polyacrylamidgel
aufgetrennt und verglichen. Hierbei werden nur sehr kleine Mengen an RNA benötigt, was die
Nachweisempfindlichkeit der Methode sehr groß macht. Differentiell exprimierte Fragmente
können dann isoliert und sequenziert werden. Mit dieser hohen Sensitivität ist allerdings auch
ein entscheidender Nachteil verbunden. Die geringste Variation der experimentellen
Bedingungen kann zu nicht reproduzierbaren Daten führen. Auch ist die Generierung
zahlreicher falsch positiver Klone, die keine unterschiedlich exprimierten Gene
repräsentieren, von Nachteil. Trotz dieser Problematik, die v. a. die Reproduzierbarkeit
betreffen, wurde die Methode bereits mehrfach erfolgreich angewendet. So konnte durch
Vergleich der mRNA-Population von differenzierten Chondrozyten mit in vitro kultivierten
und Retinsäure behandelten Zellen das im Knorpel exprimierte Chondromodulin-I-Gen
isoliert werden. (Dietz et al., 1999).
Zu (4): Bei der Methode der Subtraktionshybridisierung wird von einer ersten zu
untersuchenden Zellpopulation einzelsträngige cDNA synthetisiert und gegen einen
Überschuss von poly(A)-RNA (bzw. cDNA) einer zweiten Zellpopulation hybridisiert. Unter
geeigneten Bedingungen hybridisieren die cDNA-Moleküle, die in beiden Zellpopulationen
vorhanden sind. Spezifische cDNAs der ersten Zellpopulation, für die keine
korrespondierenden Transkripte in der zweiten Zellpopulation vorhanden sind, können
angereichert und kloniert werden. Der Vorteil der Methode liegt darin, dass stark exprimierte
Transkripte durch mehrmalige Hybridisierung der cDNAs beider Zellpopulationen eliminiert
werden können und somit die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, seltene Transkripte zu
detektieren. Die Methode hat unter anderem zur Isolierung einer Reihe tumorrelevanter Gene
geführt. Allerdings ist die Methode sehr aufwendig und es können jeweils nur zwei
Zellpopulationen miteinander verglichen werden. Der Vergleich einer größeren Anzahl von
Zellpopulationen ist somit nicht praktikabel.
Zu (5): Die SAGE Technik (“serial analysis of gene expression”) basiert auf der Generierung
und quantitativen Auswertung von kurzen, mRNA-spezifischen 12 Bp-Sequenzabschnitten
(Velculescu et al., 1995). Die Herstellung einer SAGE-Bibliothek erfordert zahlreiche
enzymatische Schritte. Nach Erzeugung von doppelsträngiger cDNA wird diese mit einem 4-
Basenpaar-Erkennungsrestriktionsenzym geschnitten. Nach Halbierung des Ansatz wird an
jede Hälfte ein spezifisches Linkerpaar ligiert. Besonderheit dieser Linker ist, dass sie eine
Typ-II-Restriktionserkennungssequenz besitzen, so dass nach Ligation der Ansätze, die
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