Allgemeine Mikrobiologie

84 3Pilze
Box3.2 SporenfarbealsMarker
beiderAscusanalyse
DurchdieschlauchförmigeMorphologiedes
Ascus ist bei den Zellteilungen der Meiose
(und der nachfolgenden postmeiotischen
Mitose)kein„Platztausch“derentstehenden
8 Zellen möglich. An der Stelle, an der sie
entstandensind,liegendieSporenimAscus.
DaindensichteilendenKernendieChromosomen
durch die Spindel verteilt werden,
und die Spindel an den Centromeren der
Chromosomen ansetzen, ist die Lage der
SporenimAscusdurchdieLagederCentromeren
bei der ersten meiotischen Teilung
vorherbestimmt. Ist die Chromosomenverteilungalsozufälligso,dassdasChromosom
mit wildtypfarbenen, schwarzen Sporen
obenliegtunddasChromosommitdergelbenFarbmutationunten,dannentstehenim
Ascus unten 4 gelbe und oben 4 schwarze
Sporen. Dies wäre eine reguläre 4:4-Verteilung,
wie sie immer dann erwartet werden
kann, wenn keine weiteren Prozesse wie
z.B.Rekombinationstattgefundenhaben.
Durch Rekombination zwischen dem Farbmarker
und dem Centromer entsteht dagegen
eine abweichende Verteilung (Abb.
3.14b). Bei der Rekombination wurde ein
Chromosomenarm vertauscht. Damit wird
das Chromosom mit der ursprünglich auf
beiden Chromatiden liegenden Wildtypsequenz
so verändert, dass ein Chromatid
jetzt die „gelbe“ Mutation trägt. Dementsprechend
trägt das entsprechende Chromatid
des Schwesterchromosoms jetzt das
Wildtypallel. Die Anzahl der mutierten und
nicht mutierten Chromatiden bleibt aber
insgesamt gleich. Dadurch werden jetzt
2 schwarze und 2 gelbe Sporen unten und
2schwarze und2gelbeSporenobengebildet,
es kommt damit zu einer aberranten
4:4-Verteilung(2:2:2:2).
Durch Auszählen der Asci mit aberranter
Sporenverteilung kann man bestimmen,
wie oft eine Rekombination stattgefunden
hat.DieRekombinationshäufigkeitistdamit
ein direktes Maß für den genetischen Abstanddes
MarkersvomCentromer.DerAbstandzweierGene,dersobestimmtwurde,
wird in der Genetik in der Einheit Morgan
angegeben (nach Thomas Hunt Morgan,
der diese Einheit definiert hat). Bei den haploidenAscomycetenentsprichtdieRekombinationsfrequenz
zwischen zwei Markern
(hier Centromer und Farbmutation) direkt
derAngabeincentiMorgan.
Merkmalen erst mit einem rezessiven Elternteil rückgekreuzt werden,
damit in der F2-Generation die Auswirkungen rezessiver Mutationen
sichtbarwerden.BeiachtsporigenAscomycetenjedochwirdeine4:4-VerteilungderSporenfarbendirektsichtbar(Abb.3.14a).Rekombinationmit
anschließendenReparaturereignissenführenzuabweichendenVerteilungenwieeiner5:3oder6:2-VerteilungderSporenfarbenimAscus.Hier
liegteineGenkonversionvor,beiderzuBeginnderMeiosedieInformation
eines Einzelstrangs (5:3) oder eines Doppelstrangs (6:2) entfernt
wurdeunddieanschließendeReparaturanhandeinesnichthomologen
BereichsdesSchwesterchromosomserfolgte(Abb.3.14b,Box3.2).
3.9.2 MolekulargenetikmiteukaryontischenSystemen
BeiderBäckerhefekönnenPlasmidealsfreireplizierendeVektoreneingesetztwerden,wiedasauchbeiEscherichiacolimöglichist.DazumüssendiePlasmideeinenReplikationsursprungtragen,derz.B.auseinem
natürlichenPlasmidstammenkann.Einsolches,freireplizierendesPlasmidistdas2mmgroße2m-PlasmidderHefe.Esenthältdassog.2m-Element,
das häufig als Replikationsursprung eingesetzt wird. Es können
aberauchSequenzenbenutztwerden,diedenReplikationsursprüngen
auf den Chromosomen entsprechen. Diese Sequenzenermöglichen die
ReplikationvonextrachromosomalenSequenzenundwerdendaherals
autonom replizierende Sequenzen oder ARS-Elemente bezeichnet. Bei
derKnospungkann die Verteilung vonPlasmiden, insbesonderewenn
sieingeringerKopienzahlvorliegen,instabilsein,dasiezufälligaufdie
beiden Tochterzellen verteilt werden. Damit eine stabile Weitergabe
erreichtwird,könnensolche Plasmide mit Centromersequenzen, CEN-
Regionen,ausgestattetwerden.DieCEN-Regiongarantiert,dassdiePlasmideüberdieTeilungsspindelanbeideTochterzellenweitergegebenund
sogleichmäßigverteiltwerden.AlsSelektionsmarkereignensichneben
Resistenzgenen auch Gene für die Biosynthese von Aminosäuren oder
Uracil.SokönnenStämme,dieTryptophannichtmehrselbstsynthetisierenkönnen,mitdementsprechendenSynthesegenkomplementiertwerdenundsinddannwiederinderLage,aufeinemMediumohneTryptophanzuwachsen.
Neben solch frei replizierenden Plasmiden sind aber auch Integrationsvektorengebräuchlich(Abb.3.15).DiesetragenlediglichdenSelektionsmarkerundwerdendurchIntegrationinsWirtsgenomstabilweitergegeben.
Solche Vektoren sind insbesondere für filamentöse Pilze
gebräuchlich,fürdieinderRegelkeinePlasmidealsVektorenzurVerfügungstehen.DieIntegrationerfolgtektopisch,alsoannichthomologen
StellenimGenomdesPilzes.WeitereAnforderungenandietransformierendeDNAmüssenkaumgestelltwerden,weilsowohlcirculärealsauch
lineareFragmenteguteTransformationsergebnisseerzielen.InAbhängigkeitvombetrachtetenPilzistderErfolgvonlinearenFragmenteninder
Transformationsogarbiszu100fachhöher.
FüreineExpressionderkloniertenSequenzenmüssenpilzlichePromotorenvorhandensein.DiesesindnichtimmerleichtausderSequenz
abzuleiten, da die für Eukaryonten typischen ElementeCAAT-Box und
TATA-Sequenzoftfehlen.InHymenomycetenkonnteaußerdemgezeigt
werden,dassIntronsfüreineExpressionessenziellseinkönnen,wobei
das Intronnicht notwendigerweisein dercodierendenSequenzliegen
muss,sondernauchimnichttranslatiertenBereichdermRNAangeordnet
seinkann.
Aus Fuchs, G. : Allgemeine Mikrobiologie (ISBN 978-313-444608-1) © Georg Thieme Verlag KG 2007
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