Allgemeine Mikrobiologie

15.9DNA-Klonierung 477
Abb.15.17 PrinzipderDNA-Klonierung.VektorundzuklonierendeFremd-
DNA werden mit einer Restriktionsendonuklease (z. B. BamHI) behandelt und
anschließend gemischt. Passende Enden lagern sich zusammen und werden
durchDNA-Ligasekovalentverknüpft.NachTransformationwerdenresistente,
alsoplasmidtragendeE.-coli-Kolonienselektiert.P,Plasmid.
Gemische von DNA-Fragmenten getrennt werden können. Außerdem
werdeneinigegebräuchlicheVektoren(genetischeElemente,diefremde
DNAaufnehmenunddieReplikationgewährleisten)zurKlonierungvorgestelltundschließlichwirddaraufeingegangen,wieauseinerVielzahl
vonKlonenineinerGenombibliothekdiejenigenKloneselektiertwerden
können,dieeinspezifischesDNA-Fragmenttragen.
15.9.1 PlasmidealsVektoren
JenachZielsetzungdesKlonierungsexperimentsundderGrößederzu
klonierendenDNAkommenunterschiedlicheVektorenzumEinsatz.PlasmidewerdenhäufigalsVektorenverwendet,besondersdann,wennkleinereDNA-Fragmente(etwa2kb)kloniertwerdensollen.Generellkönnen
in Plasmide auch erheblich größere Fremd-DNA-Abschnitte eingebaut
werden. Es gibt allerdings effizientere Methoden, um größere DNA-
Molekülezuklonieren.Wiewirweiteruntensehenwerden,eignensich
für die Konstruktion von Genombibliotheken u.a. Vektoren, die von
Phagenabgeleitetsind.
PlasmidvektorensindAbkömmlingevonnatürlichenResistenzplasmiden.NatürlichePlasmidesindfürdieGentechnikausmehrerenGründen
ungeeignet:SiekommenmeistnuringeringerKopienzahlinderZelle
vor,sindwegenihrerGrößevonz.T.mehrals100kbzerbrechlichund
sindhäufigkonjugativ,d.h.siekönnendurchZellkontaktvonZellezu
Zelle übertragen werden. Letzteres ist auch aus Sicherheitsgründenin
vielenFällenunerwünscht.InAbbildung15.18isteinBeispielfüreinen
etwa3kbgroßenPlasmidvektorgezeigt,derinetwa30–40Kopienin
einerE.-coli-ZellevorkommtundeineinfachesVerfahrenzumNachweis
voneingebauterDNAerlaubt.DiesesPlasmidenthältdenReplikationsursprung(oriV)desnatürlichenPlasmidsColE1,einResistenzgen(bla),
das Resistenz gegen Ampicillin vermittelt, und eine multiple Klonierungsstelle(engl.multipleclonigsite,MCS).Dabeihandeltessichum
etwa100bp,dieineinemAbschnittdeslacZ-Gens(lacZa)angeordnet
sind und mehrere Erkennungsstellen für verschiedene Typ-II-Restriktionsendonukleasenenthalten.DerVektorwirdindemBereichderMCS
geöffnetundmitderFremd-DNAverknüpft.AnschließendwirdderAnsatzinE.-coli-Zellentransformiert.DieZellenwerdenaufNähragarmit
Ampicillinundderchromogenen(d.h.nochfarblosen)Substanz XGal
ausplattiert. Nur diejenigenZellen überlebenund bilden Kolonien,die
dasPlasmidaufgenommenhaben.Umzuprüfen,welcheVektorenauch
tatsächlichdieFremd-DNAinderMCStragen,istdasGenproduktdes
lacZ-Gens,die b-Galactosidasebehilflich.LeereVektorenhabenintaktes
lacZa,dakeineFremd-DNAeingebautwurde,die b-Galactosidaseistaktiv,
spaltetXGalunddieKolonienfärbensichblau.EingebauteFremd-DNA
dagegen zerstört das lacZa-Gen, das Genprodukt ist nicht aktiv und
kannXGalnichtspalten.DieKoloniensinddaherfarblos.DasSelektionsverfahren
wird aus diesem Grund auch als Blau/Weiß-Selektion bezeichnet.
Aus Fuchs, G. : Allgemeine Mikrobiologie (ISBN 978-313-444608-1) © Georg Thieme Verlag KG 2007
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