Allgemeine Mikrobiologie
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482 15ProkaryontischeGenetikundMolekularbiologie<br />

E. coli eingebracht. Abdrücke der Bakterienkolonien oder Plaques auf<br />

Membranfiltern werden mit markierten Sonden untersucht. Bei der<br />

SondekannessichumeineinzelsträngigesOligonukleotidhandeln,dessenSequenzz.B.ausderAminosäuresequenzdesrelevantenProteinsabgeleitetwordenist.DadergenetischeCodedegeneriertist,d.h.denmeistenAminosäurenmehralseinCodonzugeordnetwerdenkann,werden<br />

meistensGemischevonOligonukleotideneingesetzt.ZumNachweisder<br />

Sondenwerdendiesez.B.miteinemFluoreszenzfarbstoffodermitradioaktivemPhosphormarkiert.DieSondebindetankomplementäreDNA<br />

positiverKlone,mansprichtvonHybridisierung,undwirdanschließend<br />

sichtbargemacht.<br />

15.10 DNA-SequenzierungundGenomsequenzen<br />

SeitMitteder1970er-Jahreistesmöglich,dieSequenzderNukleotidein<br />

DNA-Molekülenexperimentellzubestimmen.Etwa20Jahrespäterwurde<br />

damitbegonnen,dievollständigenGenomsequenzenvielerProkaryonten<br />

undeinigerEukaryontenzuermittelnunddieAnzahlvollständigsequenzierterGenomewächstrasant.WirwollenunsindiesemAbschnittzunächstmitderTechnikderDNA-Sequenzierungbeschäftigen,anschließendeinenÜberblicküberdieVorgehensweisezurBestimmungkompletter<br />

Genomsequenzen gewinnen und schließlich einige mikrobielle<br />

Genomemiteinandervergleichen.<br />

Abb. 15.21 Identifizierung klonierter DNA-<br />

Fragmente durch Koloniehybridisierung. Bakterien<br />

werden zunächst mit Vektorentransformiert,<br />

die unterschiedliche Fragmente des Genoms enthalten.DieBakterienwerdendannaufAgarplatten<br />

dünnausplattiert,sodasssiezueinzelnenKolonien<br />

wachsen. Von einer solchen Originalplatte wird<br />

dann mit einem Nitrocellulosefilter ein Abdruck<br />

genommen, die am Filter haftenden Bakterien<br />

lysiert,dieDNAaufdemFilterfixiertundderFilter<br />

dann mit einer markierten Sonde hybridisiert.<br />

Überschüssige Sonde wird dannunter so genannten<br />

stringenten Bedingungen abgewaschen, sodass<br />

nur komplementär gebundene Sondenmoleküle<br />

haften bleiben. Diese können dann auf dem<br />

Filter sichtbar gemacht werden. Die positiven<br />

KolonienwerdenvonderOriginalplatteisoliert.<br />

15.10.1 Genomsequenzierung<br />

WieTabelle15.4,S.484entnommenwerdenkann,liegendieGrößenprokaryontischerGenomezwischenwenigeralsetwa0,5Mbundmehrals<br />

10Mb;diegrößteneukaryontischenGenomekönnennochetwa1000fach<br />

größersein.DerhaploideChromosomensatzdesMenschenenthältz.B.<br />

knapp3MilliardenBasenpaare,abermitvermutlichwenigerals25000<br />

Genennichteinmal10fachmehrGenealseintypischesBakterium.Vergleicht<br />

man diese Dimensionen mit der Leseweite einer einzigen<br />

Sequenzierungsreaktion(Box15.4),dannwirdoffensichtlich,wieviele<br />

Einzelreaktionen(engl.reads)fürdieSequenzierungeinesvollständigen<br />

Genomsnotwendigsind.ZurAbsicherungderDatenisteszudemerforderlich,dassjedeseinzelneNukleotidmehrfachinunabhängigenSequenzierungsreaktionenerfasstwird,mansprichtvonmehrfacherAbdeckung<br />

(engl. coverage). Für die Entzifferung eukaryontischer Genome ist es<br />

günstig,eingeordnetesGerüstinFormvonüberlappendenBAC-Klonen<br />

(BacterialArtificialChromosome,Kap.15.9.4)zukonstruieren.DieDNA<br />

isolierterBACswirddanninkleineFragmentezerlegt,subkloniertund<br />

sequenziert. Anschließend werden überlappende Sequenzen einzelner<br />

Reads zu zusammenhängendenSequenzen(so genanntenContigs) assembliertundeswirdversucht,dieverbliebenenLückendurchweiteres<br />

Sequenzierenzuschließen,bisdieSequenzeinesBAC-Klonsvollständig<br />

ist.DiesesVerfahrenwirdKlonfürKlondurchgeführt.DieVerfügbarkeit<br />

geordneterBankenisthilfreich,ihreKonstruktionaberaufwändig.<br />

BesondersfürdieAnalysekleiner,prokaryontischerGenomehatsich<br />

ein als Shotgun-Sequenzierung bezeichnetes Verfahren durchgesetzt,<br />

dasaufgeordneteBankenausBAC-undCosmidklonenweitgehendverzichtet.<br />

Bei diesem Schrotschussverfahren wird genomische DNA in<br />

einerNebelkammermechanischfragmentiert.Anschließendwerdendie<br />

vielenBruchstückechromatografischnachihrerGrößegetrennt.Fürdie<br />

Aus Fuchs, G. : <strong>Allgemeine</strong> <strong>Mikrobiologie</strong> (ISBN 978-313-444608-1) © Georg Thieme Verlag KG 2007<br />

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