Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

ERGEBNISSE 89
Die mRNA-Level der Gene, die für die Aldehyd-Dehydrogenasen A1dA und A1dB
kodieren, waren erniedrigt. Obwohl die Gene aldA und aldB an unterschiedlichen Regionen
im Genom von E. coli lokalisiert sind, katalysieren beide Enzyme zum einen die Umsetzung
von L-Lactaldehyd zu L-Lactat und zum anderen die Umsetzung von Methylglyoxal zu
Pyruvat (http://www.genome.ad.jp/kegg/kegg2 .html ) .
Unter den Genen mit erhöhtem RNA-Level nach Pyruvat-Zugabe befand sich proP, das für
eine Prolin-Permease kodiert, pdhR, das für den transkriptionellen Regulator des Pyruvat-
Dehydrogenase-Komplexes kodiert, ndh für die NADH-Dehydrogenase II, sowie lipA und
pgiA .
8 Vergleichende Proteomanalysen durch zweidimensionale Gelelektrophorese und
Peptidmassenfingerprint-Analyse
8 .1 Vergleich von E. coli MG1655 und E. coli YYC202 bei Wachstum in
Minimalmedium mit Glucose und Acetat
Um Veränderungen im Proteinmuster bei dem E. coli Wildtyp-Stamm MG1655 und dem
Pyruvat-Produzenten YYC202 festzustellen, wurden die Proteine durch 2D-Gelelektrophorese
aufgetrennt . Dabei werden Proteingemische zunächst durch eine isoelektrische Fokussierung
nach ihrem isoelektrischen Punkt aufgetrennt (1 . Dimension) und anschließend durch SDS-
PAGE nach ihrer Größe (2 . Dimension) . Für die Proteomanalyse wurden die Stämme
zunächst in Minimalmedium mit 10 mM Glucose und 2 mM Acetat kultiviert . Unter diesen
Bedingungen produziert YYC202 im Gegensatz zu MG1655 Pyruvat. Zur Herstellung des
Proteinrohextraktes wurden Zellen in der exponentiellen Phase (durchschnittliche
Wachstumsrate 0,45 h-1 ) bei einer OD600 von -0,4 geerntet, mittels French-Press
aufgeschlossen und anschließend zentrifugiert, um noch intakte Zellen und Zelltrümmer zu
entfernen . Danach erfolgte zur Abtrennung der Membranen eine Ultrazentrifugation des
zellfreien Extraktes . Der daraus resultierende Überstand, der die löslichen Proteine enthielt,
wurde zur 2D-Elektrophorese verwendet (Abb . 27) . Die Protein-Muster von YYC202 und
MG1665 wurden visuell miteinander verglichen, dabei wurden je 2 Gele für jeden Stamm
gemacht und ausgewertet . Proteine, die in ihrer Intensität verändert waren, wurden durch eine
Peptidmassenfingerprint-Analyse identifiziert . Hierzu wurden die aus dem Gel ausgestanzten
Proteinspots mit Trypsin verdaut, die tryptischen Peptide aus dem Gel eluiert und danach
mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert. Die so erhaltenen