Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

ERGEBNISSE 65
Die Wirksamkeit des Abbaus des elektrochemischen Protonenpotentials hängt von
verschiedenen Faktoren ab, z.B . der Entkoppler-Konzentration, der Rate, mit der der
elektrochemische Protonengradient durch die Atmungskette aufgebaut wird und der
Protonenkonzentration . Bei höheren Protonenkonzentrationen sollte der Abbau beschleunigt
werden . Aus dieser Überlegung heraus wurde der Einfluss von CCCP auf die Glucose-
Umsetzung durch Zellsuspensionen von E. coli YYC202 bei pH 6, 6,5, 7, 7,5 und 8 getestet .
Den Zellsuspensionen wurde bereits zu Beginn der Inkubation 20 ~,M CCCP zugesetzt (Abb .
20) . Den Kontrollen wurden entsprechende Volumina Ethanol zugesetzt. Es stellte sich
heraus, dass die spezifischen Glucose-Verbrauchsraten zwischen pH 6,5 und 8 ohne bzw . mit
CCCP annähernd gleich waren . Bei pH 6 wurde die Glucose von Beginn an sehr langsam und
auch nicht vollständig verstoffwechselt . Nach etwa 5 Stunden stoppte die Glucose-
Umsetzung . Der Glucose-Transport wird nicht durch die protonenmotorische Kraft (pmf)
getrieben . Glucose wird über das PEP-abhängige Phosphotransferase-System (PTS-System)
in die Zelle aufgenommen . CCCP sollte demnach keinen direkten Einfluss auf den Glucose-
Transport haben und der bei pH 6 beobachtete Effekt könnte demnach direkt mit dem
Pyruvat-Transport zusammenhängen . Die Glucose wird zum überwiegenden Teil in der
Glykolyse zu Pyruvat umgesetzt. Ist nun wie bei YYC202 die Umsetzung von Pyruvat
blockiert und kann Pyruvat aufgrund einer reduzierten pmf nicht mehr mit voller Effizienz
exportiert werden, kommt es zu einem Anstau von Glykolyse-Intermediaten, was einen Stop
in der Glucose-Aufnahme zur Folge hätte .
Es wurden weitere Experimente bei pH 6, 7 und 8 mit höheren CCCP-Konzentrationen
durchgeführt . Hierzu wurden YYC202ldhA-Zellsuspensionen nach einer Inkubationszeit von
2 Stunden mit 100 ~M CCCP bzw . mit Ethanol als Kontrolle versetzt . Die spezifischen
Glucose-Verbrauchsraten und Pyruvat-Bildungsraten waren bis zur Zugabe von CCCP bei
allen pH-Werten annähernd gleich . Erst nach Zugabe von 100 gM CCCP zeigte sich ein sehr
deutlicher Unterschied . Bei pH 7 und 8 waren die Raten in den Ansätzen mit CCCP und mit
EtOH (als Kontrolle) etwa gleich . Bei pH 6 hingegen wurde die Glucose-Umsetzung und
damit natürlich auch die Pyruvat-Bildung nach CCCP-Zugabe praktisch vollständig inhibiert
(Abb . 21) . Trotz einer fünffach erhöhten CCCP-Konzentration trat also auch in diesem
Experiment der drastische Hemmeffekt erst bei pH 6 auf.