Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

MATERIAL UND METHODEN 15
5 Kultivierungsbedingungen und Stammhaltung von Bakterien
5 .1 Nährmedien und Kultivierungsbedingungen
E. coli-Stämme wurden routinemäßig in Luria-Bertani-Medium (LB : 10 g/1 Trypton
(Difco), 5 g/1 Hefeextrakt (Difco), 5 g/1 NaCI), modifiziert nach Sambrook (1989) kultiviert .
Zur "phänotypischen Expression" der Antibiotikaresistenz von frisch transformierten Zellen
wurde SOC-Komplexmedium eingesetzt (20 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 0,6 g/1 NaCI,
0,2 g KCI, nach dem Autoklavieren wurden je 10 ml/1 einer 2 M Glucoselösung und einer
2 M Magnesiumsalzlösung (1 M M9C1 2 und 1 M M9S04 ), die zuvor sterilfiltriert wurden,
zugeben) (Miller & Nickoloff, 1995) . Die acetatauxotrophen E. coli-Stämme YYC202
(Georgiou et al., 1987) und YYC202ldhA (Gerharz et al., 2002) wurden routinemäßig in M9-
Minimalmedium (pH 7) mit Zusatz von 10 mM Glucose und 2 mM Natriumacetat kultiviert
(6 g/1 Na2HPO4 , 3 g/1 KH 2P0 4, 0,5 g/1 NaCI, 1 g/1 NH4C1, nach dem Autoklavieren wurden
1 MM M9S04 und 1 mM CaC12 zugeben ; Sambrook (1989)) . Zur Herstellung von Agarplatten
wurden den Medien 1,5 % (w/v) Agar zugesetzt . Für die selektive Kultivierung wurden die
autoklavierten Medien nach dem Abkühlen mit den in Tab . 4 angegebenen Antibotika-
Konzentrationen versetzt .
Tab . 4 : Antibotika-Konzentrationen, die selektiven Medien zugesetzt wurden .
Antibiotikum Endkonzentration Stammlösung
Tetracyclin 10 lug ml - 4 mg ml - in Ethanol
Streptomycin 25 lug ml -1 10 mg ml -1 in H20
Ampicillin 100 lug ml-1 100 mg ml -1 in H20
Chloramphenicol 40 lug ml-1 10 mg ml -1 in Ethanol
Kanamycin 50 lug ml -1 20 mg ml -1 in H20
Falls nicht anders vermerkt, wurden die E. coli-Stämme in Schüttelkolben bzw . auf
Petrischalen bei 37°C inkubiert . Die Kultivierungen zur DNA-Isolierung erfolgten im
Allgemeinen in Reagenzgläsern mit 5 ml Vollmedium (LB oder SOC), die für 15-20 h mit
170 U.p .m . geschüttelt wurden . Für Wachstumsversuche wurden 500-ml-Erlenmeyerkolben
mit zwei seitlichen Schikanen verwendet, die 50 ml Medium enthielten und nach dem
Animpfen mit 140 U .p.m . geschüttelt wurden .