Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

1 6 MATERIAL UNDMETHODEN
Um Zellsuspensionen von YYC202 bzw . YYC202ldhA zu erhalten, wurden die Zellen
zunächst wie oben beschrieben in M9-Minimal-Medium kultiviert . Anschließend wurden die
Zellen mit 0,9 % (w/v) NaCI gewaschen und in einem definierten Puffer mit Glucose, aber
ohne Acetat, N- oder S-Quelle resuspendiert.
In einem 2-1-KLF2000-Fernenter (Bioengineering, Wald, Schweiz) wurde die C02-
Produktion durch Zellsuspensionen analysiert . Die C02-Konzentration in der Abluft des
Fermenters wurde mit Hilfe einer COI-Abgasanalytik (Fischer Analysen, Leipzig) erfasst . Der
pH-Wert wurde durch eine automatische Dosierung von 2 N Na0H auf 7,0 konstant gehalten .
Die Belüftung erfolgte mit synthetischer Luft (80 % N2 und 20 % 02) und einer Rate von
461/h . Der 02-Partialdruck wurde mit einer amperometrischen Elektrode (Mettler-Toledo,
Steinbach) bestimmt .
5 .2 Stammhaltung
Zur Herstellung von Glycerinkulturen wurde eine 20-ml-LB-Übernacht-Kultur
abzentrifugiert (10 min, 5200 g, 4°C) und die Zellen in 2 ml LB-Medium resuspendiert . Nach
Zugabe von 2 ml sterilem Glycerin (87 %, v/v) wurde die Probe in zwei Aliquots (2 ml)
aufgeteilt und in Cryo-Röhrchen transferiert. Eine der so erhaltenen Glycerinkulturen wurde
bei -20°C, die andere bei -70°C gelagert . Diese Dauerkulturen bleiben in der Regel über Jahre
hinweg lebensfähig .
5 .3 Bestimmung von Wachstums- und Stoffwechselparametern
5 .3 .1 Bestimmung des Wachstums von Bakterien-Kulturen
Das Wachstum der Kulturen wurde durch Messung der scheinbar optischen Dichte bei
600 nm mit einem LKB Ultrospec Plus Spectrophotometer (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg) verfolgt, wobei die Kulturen so mit Wasser verdünnt wurden, dass die gemessenen
OD6oo-Werte nie größer als 0,3 waren .
5 .3 .2 Bestimmung des pH-Wertes
Der pH-Wert wurde mit einem pH-Meter (Mikroprozessor-pH-Meter 763, Knick, Berlin)
gemessen . Dazu wurde das pH-Meter mit Eichlösungen pH 4 und pH 7 bzw . pH 7 und pH 9
kalibriert .