Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

11 4 DISKUSSION
7 Proteomanalyse
Die in den Fermentationen eingesetzte Glucose sollte vorwiegend in der Glykolyse zu
Pyruvat umgesetzt werden . Wenn Glucose nicht über die Glykolyse, sondern über den
oxidativen Pentosephosphatweg verstoffwechselt wird, entsteht C02 . Dies führt zu einer
Reduktion der Pyruvat-Ausbeute . Die Erhöhung der Gluconat-6-Phosphat-Dehydrogenase im
Verlauf der acetatlimitierenden (al) Fermentation könnte für eine erhöhte Aktivität des
Pentosephosphat-Wegs sprechen, allerdings zeigten keine weiteren Enzyme dieses Weges
eine erhöhte Protein-Konzentration . Es fällt auch auf, dass in der acetatakkumulierenden (ak)
Fermentation zwei Enzyme (Gnd, TalB) des Pentosephosphatweges im Verlauf der
Fermentation reduziert wurden . Das spricht für eine reduzierte Aktivität des Pentosephosphat-
Wegs . Das Verhältnis al/ak der relativen Proteinintensität der Gluconat-6-Phosphat-
Dehydrogenase betrug am Anfang der Fermentation 0,88, in der Produktionsphase 1,7 und am
Ende der Fermentation 1,92 . Die Pyruvat-Ausbeute war in der ak-Fermentation mit -670 mM
deutlich höher als in der al-Fermentation, wo nur -380 mM Pyruvat gebildet wurden . Die
geringere Ausbeute in der al-Fermentation könnte mit einer erhöhten Aktivität des
Pentosephosphatweges zusammenhängen .
Indizien für einen Säurestress, wie sie bereits bei den DNA-Chip-Experimenten beobachtet
wurden, gab es auch bei den Proteomanalysen . So wurden z.B . die Proteine YfiD und GadB
in der Produktionsphase vermehrt gebildet. Das YfiD-Protein ist ein Protein, dass bei
Säurestress induziert wird und bei neutralem bis alkalischem pH-Wert bisher noch nicht durch
Proteomanalyse identifiziert wurde (Blankenhorn et al., 1999) . Da die Fermentationen bei
einem neutralen externen pH-Wert durchgeführt wurden, ist es deswegen um so erstaunlicher,
dass das YfiD-Protein dabei in relativ hoher Intensität detektiert wurde . Das Ergebnis
unterstützt den Befund, dass die Pyruvat-Bildung zu einer cytoplasmatischen Ansäuerung
führt . YfiD ist ein Radikal-Enzym, wobei das Radikal wie bei der Pyruvat-Formiat-Lyase
(PFL) durch die Aktivasen PflA mittels Adenosylmethionin eingeführt wird . Im Gegensatz
zur PFL fungiert AdhE aber bei YfiD nicht als Deaktivase . YfiD kann das katalytische
Zentrum von PFL wiederherstellen, wenn es durch Sauerstoffeinwirkung zerstört wurde
(Wagner et al., 2001) . Da in YYC202 das pflB-Gen für PFL durch eine Mutation inaktiviert
ist, bleibt es fraglich, ob diese Reaktivierungsfunktion von YfiD in YYC202 eine Rolle spielt .
Unter Sauerstoffmangel scheiden yfiD-Mutanten verstärkt organische Säuren wie Pyruvat,
Lactat, Succinat oder Formiat aus (Wybom et al., 2002) . Es wäre daher interessant zu
untersuchen, ob eine yfiD-Mutation in YYC202ldhA einen Einfluss auf die Pyruvat-
Produktion hätte . Bei der ak Fed-Batch-Kultur kam es im Verlauf der Fermentation zu einer