Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

4 EINLEITUNG
Alternativ zu Lactat wird Glucose als Substrat für die Pyruvat-Produktion mittels Ganzzell-
Biotransformation eingesetzt . Dazu werden Stämme verwendet, bei denen die
Decarboxylierung des Pyruvats zu Acetyl-CoA durch geeignete Auxotrophien reduziert ist . In
einem der beschriebenen Verfahren werden vitaminauxotrophe Hefe-Stämme verwendet, z.B .
Torulopsis glabrata (Miyata et al ., 1990 ; Yonehara & Miyata, 1994 ; Miyata & Yonehara,
1996) . Diese Stämme sind z.T . sowohl Thamin-, nicotinsäure-, biotin- als auch
pyridoxaminauxotroph . Wurden beispielsweise limitierende Mengen Thiamin oder
Nicotinamid eingesetzt, so führte dies zu einer Reduktion der Pyruvat-Dehydrogenase-
Aktivität und damit zu einer reduzierten oxidativen Decarboxylierung des in der Glykolyse
gebildeten Pyruvats . Da Thiaminpyrophosphat ebenfalls als Cofaktor der Transketolase
benötigt wird, hatte eine reduzierte Thiamin-Konzentration auch einen reduzierten
Pentosephosphatweg zur Folge, so dass die eingesetzte Glucose vorwiegend in der Glykolyse
umgesetzt wurde . Die Aktivität der Pyruvat-Carboxylase, die Pyruvat zu Oxalacetat umsetzt,
wurde durch limitierende Mengen Biotin reduziert, da diese Reaktion biotinabhängig ist. Ein
Pyridoxamin-Mangel führte zu einem reduzierten Aminosäure-Stoffwechsel, da viele dieser
Enzyme (Transaminasen, Decarboxylasen, Dehydratasen) Pyridoxalphosphat benötigen .
Durch eine Optimierung der Vitamin-Kombination wurden mit vitaminauxotrophen
T. glabrata-Stämmen maximal 0,57 g Pyruvat pro g Glucose im Schüttelkolben-Maßstab
gebildet, was einer Ausbeute von 1,17 Mol Pyruvat/Mol Glucose entspricht (Yonehara &
Miyata, 1994) . In Fed-Batch-Fermentationen betrug die maximal erreichte Pyruvat-
Konzentration 67,8 gll . Die Ausbeute betrug aber lediglich 1 Mol Pyruvat/Mol Glucose
(Miyata & Yonehara, 1996) .
Eine vergleichbare Methode zur Pyruvat-Produktion aus Glucose wurde auch für
liponsäureauxotrophe Escherichia coli-Stämme beschrieben (Abb . 3 ; Yokota et al., 1994a,
1994b, Yokota, 1997) . Bei den beschriebenen Prozessen erfolgt die Pyruvat-Bildung
ausgehend von Glucose unter aeroben Bedingungen . Die Glucose wird dabei zunächst über
das Phosphotransferase-System (PTS) in die Zelle aufgenommen und in der Glykolyse zu
Pyruvat umgesetzt . Der überwiegende Teil des gebildeten Pyruvats wird unter aeroben
Bedingungen durch den PDH-Komplex zu Acetyl-CoA und C0 2 umgesetzt . Dieses Enzym
benötigt Liponsäure als prosthetische Gruppe . Setzt man nun liponsäureauxotrophen
Stämmen limitierende Mengen an Liponsäure zu, so führt dies zu einer Reduktion der PDH-
Aktivität und damit zu einer verminderten Umsetzung des in der Glykolyse gebildeten
Pyruvats . Dadurch kommt es zu einem Anstau und das Pyruvat wird ausgeschieden . Hierbei
wurden maximal 25,5 gll Pyruvat aus 50 gll Glucose in 32 Stunden gebildet (1 Mol