Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

64 ERGEBNISSE
Es wurde der Einfluss von 10 ~tM, 100 ~tM und 1 mM DCCD auf Glucose-Verbrauch und
Pyruvat-Bildung durch Zellsuspensionen von E. coli YYC202 getestet. Zellsuspensionen
wurden jeweils in 0,5 M MOPS-Puffer pH 7 mit -85 mM Glucose zu einer OD600 von -3,1
resuspendiert . Nach 5 Stunden Inkubation bei 37°C und 140 U .p .m . wurden die
unterschiedlichen Konzentrationen DCCD zugesetzt. Einer Kontrolle wurde 500 ~t1 Ethanol
zugesetzt, was dem zugesetzten Volumen von 1 mM DCCD entsprach . Ethanol wurde
zugesetzt, da DCCD in Ethanol gelöst war . Bei Zusatz von 10 ~tM DCCD wurde eine leichte
Steigerung der spezifischen Pyruvat-Bildungsrate und der Ausbeute gemessen . Es war jedoch
mit zunehmender DCCD-Konzentration kaum ein Einfluss auf die spezifische bzw . absolute
Glucose-Verbrauchsrate zu erkennen, wohl aber eine Reduktion der spezifischen Pyruvat-
Bildungsrate um Faktor -2 . Die absolute Pyruvat-Produktionsrate war um etwa 30 %
reduziert . Die Ausbeute sank ebenfalls um etwa 30 % . Bei allen Versuchen wurde eine 0,1 M
DCCD-Stammlösung verwendet, was dazu führt, dass bei allen Versuchen unterschiedliche
Volumina DCCD zugegeben wurden und dementsprechend auch unterschiedliche Volumina
Ethanol, so dass man einen Effekt durch Ethanol nicht ausschließen kann . Obwohl ein leichter
Hemmeffekt von DCCD auf die Pyruvat-Bildungsrate und die Pyruvat-Ausbeute (allerdings
nur bei 1 mM DCCD) zu erkennen war, kann aufgrund dieser Daten keine Schlussfolgerung
bezüglich der ATP-Abhängigkeit des Pyruvat-Exports gemacht werden .
6 .2 .3 Einfluss von Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon auf den Pyruvat-Export
Entkoppler sind chemische Substanzen, die das elektrochemische Protonenpotential über
z .B . der Cytoplasmamembran von Bakterien abbauen und damit einerseits die Synthese von
ATP aus ADP und Pi durch die F IFo-ATP-Synthese, andererseits aber auch sekundär aktive
Transportprozesse, die durch das elektrochemische Protonenpotential getrieben werden,
inhibieren . Protonophore sind i.d.R . lipophile schwache Säuren, die die Membran aufgrund
eines großen delokalisierten 7u-Elektronensystems sowohl in der protonierten als auch in der
deprotonierten Form permeieren können (Nichollas & Ferguson, 1992) . Als Entkoppler
wirken z.B . Dinitrophenol, Dicumarol oder Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon (CCCP) .
In dieser Arbeit wurde der Einfluss von CCCP getestet . Eine E. coli YYC202ldhA-
Zellsuspension wurde in 0,5 M MOPS-Puffer pH 7 mit -85 mM Glucose zu einer OD600 von
-3,1 resuspendiert . Nach fünf Stunden Inkubation bei 37°C und 140 U .p .m . wurde der
Zellsuspension 100 ~tM CCCP zugegeben . Unter diesen Bedingungen zeigte CCCP keinen
Einfluss auf Glucose-Verbrauch und Pyruvat-Bildung .