Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

ERGEBNISSE 57
und Co-1dhA-S) als Sonde wurde in EcoRFHindlll-verdauter chromosomaler DNA des
Ausgangsstammes YYC202 erwartungsgemäß nur ein einziges Fragment von 11 kb Länge
nachgewiesen. In EcoRI/Hindlll-verdauter chromosomaler DNA des Donorstammes NZN117
und von YYC202ldhA wurden dagegen zwei Fragmente von 6,2 kb und 6,8 kb Länge
detektiert, da in diesen Stämmen durch die Insertion der Kanamycin-Kassette in ldhA eine
HindIII-Schnittstelle hinzugefügt wurde . Mit einem DIG-markierten 0,7-kb-Fragment des
Kanamycin-Resistenzgens aus NZN117 (entspricht dem PCR-Produkt mit den Primern KAN-
for 1 .1 und KAN-rev 2 .1) wurde erwartungsgemäß kein Signal in YYC202 nachgewiesen, in
YYC202ldhA und NZN117 dagegen konnten wiederum Fragmente von 6,2 kb und 6,8 kb
Länge detektiert werden .
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 bp
- 21226
9416
6557
5000
4100
3530
- 2322
- 2000
- 1584
Abb. 16 : Southern-Blot-Analyse (Southern, 1975) von YYC2021dhA (siehe vorherige Seite) . Die
Spuren 1, 5, 6 und 10 enthalten je 75 ng DIG-markierten DNA-Standard II und III (Roche Diagnostics) .
Die Spuren 2 und 7 enthalten chromosomale DNA von YYC202, die Spuren 3 und 8 chromosomale
DNA von YYC2021dhA und die Spuren 4 und 9 chromosomale DNA von NZN117 . Pro Spur wurden
jeweils 15 gg chromosomale DNA aufgetragen, die mit EcoR1 und Hindlll verdaut worden war . Die
DNA-Fragmente wurden auf einem 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt und nach Denaturierung auf eine
Nylon-Membran geblottet . Der Blot mit den Spuren 1-5 wurde mit einem DIG-markierten 668-bp-
Fragment des Kanamycin-Resistenzgens aus NZN117 hybridisiert, der Blot mit den Spuren 6-10 mit
einem DIG-markierten 2153-bp-DNA-Fragment des IdhA-Gens .
Zur phänotypischen Charakterisierung der ldhA-Mutante wurde zunächst die NAD +-
abhängige Lactat-DH-Aktivität (LdhA-Aktivität) von YYC202 und YYC202ldhA nach 6-
stündiger Kultivierung in LB-Medium mit 0,4 % (w/v) Glucose bestimmt . Dazu wurden