Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

56 ERGEBNISSE
4 Konstruktion und Charakterisierung eines E. coli YYC202-Stammes mit fehlender
D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität (YYC202ldhA)
E. coli besitzt drei verschiedene Lactat-Dehydrogenasen (LDH) . Zwei davon sind
membranassoziierte Enzyme, die D- bzw . L-Lactat irreversibel zu Pyruvat umsetzen und die
Reduktionsäquivalente auf Ubichinon oder Menachinon übertragen (Garvie, 1980) . Diese
Enzyme werden bei Wachstum auf Lactat benötigt . Die dritte LDH ist ein NAD+-abhängiges,
D-Lactat-spezifisches Enzym, welches D-Lactat aus Pyruvat bildet (Tarmy & Kaplan, 1968a;
Tarmy & Kaplan, 1968b) . Die Synthese dieser fermentativen, durch ldhA kodierten LDH wird
durch eine Kombination aus Anaerobiose und Säure induziert (Bunch et al., 1997) . Unter
aeroben Bedingungen gibt es eine pH-unabhängige Basis-Expression (Jiang et al ., 2001) .
Pyruvat ist nicht nur Substrat der NAD +-abhängigen LDH, sondern wirkt auch als
allosterischer Aktivator des Enzyms (Pecher et al., 1983 ; Tarmy & Kaplan, 1968b) und als
Induktor seiner Synthese . Eine neuere Arbeit zeigte, dass Pyruvat die Expression des ldhA-
Gens zwei- bis vierfach stimuliert (Jiang et al., 2001) . Der KmWert für Pyruvat liegt je nach
pH-Wert zwischen 4,4 mM (pH 6,7) und 7,2 mM (pH 7,5) (Tarmy & Kaplan, 1968b) . Diese
Konzentrationen werden in E. coli-Wildtyp-Stämmen unter aeroben Bedingungen
normalerweise wohl nicht erreicht . Im Stamm YYC202 dagegen wird aufgrund der Blockade
des Pyruvat-Abbaus dessen Konzentration wahrscheinlich deutlich größer sein als in einem
Wildtyp-Stamm und dann sowohl eine verstärkte ldhA-Expression als auch eine erhöhte
Aktivität des Enzyms bewirken . Damit lässt sich die signifikante Lactat-Bildung bei
Kultivierung von YYC202 mit hohen Glucose-Konzentrationen erklären .
Um die Bildung des Nebenprodukts Lactat zu unterbinden, wurde versucht, das ldhA-Gen
im Stamm YYC202 zu deletieren bzw . zu inaktivieren . Die Versuche zur Deletion mit der
von Link et al . (1997) beschriebene Methode mit dem Plasmid pK03 waren nicht erfolgreich .
Es konnte zwar ein pK03-Derivat mit einem 1,2-kb- Crossover"-PCR-Fragment konstruiert
werden, das die ldhA-flankierenden Bereiche umfasste (pK03-ldhA), die Integration des
Plasmids in das Chromosom von E. coli MG1655 oder YYC202 gelang jedoch nicht. Daher
wurde alternativ versucht, eine ldhA-Mutante von YYC202 mittels Plvir Transduktion
(Silhavy et al., 1984) zu konstruieren . Als Donor diente dabei der Stamm NZN117
(ldhA : :Kan) (Bunch et al., 1997), in dem das ldhA-Gen durch Insertion eines Kanamycin-
Resistenzgens inaktiviert wurde . Die erfolgreiche Transduktion in den Stamm YYC202
wurde durch eine Southern-Blot-Analyse bestätigt (Abb . 16) . Mit einem DIG-markierten 2,2-
kb-DNA-Fragment des ldhA-Gens (entspricht dem PCR-Produkt mit den Primern No-1dhA-S