Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

ERGEBNISSE 6 1
6 Untersuchungen zum Pyruvat-Transport in E. coli
Die Pyruvat-Aufnahme von E. coli wurde bisher biochemisch mit Zellen und
Membranvesikeln charakterisiert (Lang et al., 1987) . Für Zellen wurde gezeigt, dass die
Pyruvat-Aufnahme mit einem KmWert von 20 ~,M in der mittleren exponentiellen Phase
maximal ist und zu 85-95 % durch Entkoppler wie CCCP und Dinitrophenol gehemmt wird .
Auch Cyanid und Azid bewirkten eine 50-60 %ige Hemmung der Pyruvat-Aufnahme . Bei
Verwendung des artifiziellen Elektronendonator-Systems Ascorbat/Phenazinmethosulfat
konnte Pyruvat in Membranvesikeln 7-10-fach über der externen Pyruvat-Konzentration
ankonzentriert werden . Ähnlich wie bei ganzen Zellen lag der KmWert bei 15 gM und der
Transport wurde durch CCCP und Dinitrophenol zu 90% gehemmt . Diese Daten deuten
darauf hin, dass Pyruvat in E. coli über einen sekundär aktiven Transport in die Zelle
aufgenommen wird . Das Gen oder die Gene für diesen Transporter wurden bisher nicht
identifiziert .
Im Gegensatz zum Import gibt es bis heute keine Untersuchungen zum Export von Pyruvat .
Analysen von Kulturproben einer Fed-Batch-Fermentation mit dem Stamm YYC202 durch B .
Zelié (Institut für Biotechnologie 2) ergaben, dass die intrazelluläre Pyruvat-Konzentration
während der Fermentation von 30 gM auf etwa 6 mM anstieg, während die extrazelluläre
Konzentration von 1,5 mM auf 500 mM anstieg . Demzufolge wäre die interne Pyruvat-
Konzentration immer etwa 100-fach niedriger war als externe, was auf einen aktiven Export
von Pyruvat hindeuten würde .
6 .1 Co-Verstoffwechselung von Glucose und Pyruvat durch MG1655
Um zu untersuchen, ob der Pyruvat-Import einer Glucose-Repression unterliegt, wurde
MG1655 in Minimalmedium mit Glucose und Pyruvat kultiviert . Wie in Abb . 19 gezeigt,
wurden beide C-Quellen parallel verstoffwechselt . Es ist außerdem das Wachstum mit
Glucose bzw . Pyruvat als alleiniger C-Quelle dargestellt . Die maximale spezifische Glucose-
Verbrauchsrate war bei Wachstum mit Glucose als einziger C-Quelle und bei Wachstum mit
Glucose plus Pyruvat praktisch identisch (0,31 ~umol min- ' (mg Protein)-1 ) . Demgegenüber
war die maximale spezifische Pyruvat-Verbrauchsrate bei Wachstum mit Pyruvat als einziger
C-Quelle doppelt so hoch (0,82 ~tmol min- ' (mg Protein) - 1) wie bei Wachstum mit Pyruvat
plus Glucose (0,43 ~tmol min- ' (mg Protein) -1 ) . Demnach hat Pyruvat keinen Einfluss auf die
Umsetzung der Glucose, während Glucose die Pyruvat-Umsetzung partiell hemmt . Trotzdem