Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

DISKUSSION 105
Interessant ist in diesem Zusammenhang, dass der Stamm YYC202 nicht auf Acetat als
einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen konnte . Für das Wachstum auf Acetat ist
der Glyoxylatzyklus als anaplerotische Reaktion essentiell sowie die PEP-Carboxykinase, die
Oxalacetat und ATP in PEP, C02 und ADP umsetzt und somit die Gluconeogenese
ermöglicht . Das Malat-Enzym, das Malat zu C02 und Pyruvat umsetzt, kann in YYC202 die
PEP-Carboxykinase nicht ersetzen, da aufgrund der Inaktivierung des pps-Gens die Bildung
von PEP aus Pyruvat durch die PEP-Synthetase nicht möglich ist . Eine mögliche Ursache für
das fehlende Wachstum von YYC202 auf Acetat könnte eine völlig fehlende oder stark
reduzierte Aktivität des Glyoxylatzyklus sein . Beim Vergleich von YYC202- und MG1655-
Zellen, die auf Minimalmedium mit Glucose und Acetat kultiviert worden waren, zeigte sich,
dass der mRNA-Level von aceA (Isocitrat-Lyase), aceB (Malat-Synthase A) und aceK
(Isocitrat-DH-Kinase/Phosphatase) in YYC202 z.T . fast 10-fach reduziert war im Vergleich
zu MG1655 (Tab . 19) und dass Isocitrat-Lyase und Malat-Synthase zwar auf 2D-Gelen von
MG1655 präsent waren, nicht aber auf 2D-Gelen von YYC202 (Abb . 27) . Die Expression des
aceBAK-Operons unterliegt einer komplexen Kontrolle durch mehrere Proteine : das
Katabolit-Repressor/Aktivator-Protein Cra und der Integration host factor IHF fungieren als
Aktivatoren, Ic1R als Repressor . Das stromaufwärts vom aceBAK-Operon gelegene ic1R-Gen
wird seinerseits durch den Regulator des Fettsäureabbaus FadR aktiviert (Clark & Cronan,
1996) . Falls das Fehlen von Isocitrat-Lyase und Malat-Synthase die einzige Ursache für das
fehlende Wachstum von YYC202 auf Acetat ist, sollte nach Transformation mit einem
aceBAK-Expressionsplasmid das Wachstum wieder möglich sein . Welche Mutationen
letztendlich zur veränderten Regulation des aceBAK-Operons in YYC202 führten, wurde
bisher nicht untersucht . Auch die Frage, ob diese veränderte Regulation wichtig ist für die
parallele Umsetzung von Glucose und Acetat, ist noch offen . Wiederum könnte der mit einem
aceBAK-Expressionsplasmid transformierte YYC202-Stamm Hinweise zur Antwort liefern .
2 Die Acetat-Toleranz von E. coli YYC202
E. coli YYC202 hat eine ungewöhnlich hohe Resistenz gegenüber Acetat im Vergleich zu
anderen E. coli-Stämmen wie beispielsweise MG1655 . Der toxische Effekt von Acetat wird
damit erklärt, dass die protonierte Form, also die neutrale Essigsäure, über die
Cytoplasmamembran diffundieren kann . Wenn der intrazelluläre pH alkalischer ist als der
extrazelluläre, dissoziiert die Essigsäure im Cytoplasma und setzt ein Proton frei . Dadurch
wird der intrazelluläre pH reduziert und der transmembrane pH-Gradient abgebaut, was zu
einer Reduktion der protonenmotorischen Kraft und somit der ATP-Synthese führen sollte .