Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

MATERIAL UND METHODEN 23
pelletierten Zellen wurden in 1/a Kulturvolumen eiskalter 50 MM CaC12-Lösung resuspendiert
und erneut abzentrifugiert (10 min, 4500 g, 4°C) . Das Zellsediment wurde vorsichtig in
0,625 Kulturvolumen eiskalter 50 MM CaC12-Lösung resuspendiert und anschließend 30 min
auf Eis inkubiert . Danach wurden die Zellen wiederum abzentrifugiert, vorsichtig in
0,05 Kulturvolumen eiskalter 50 MM CaC12-Lösung resuspendiert und 15 min auf Eis
inkubiert. Anschließend wurde Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 10 % (v/v)
zugegeben und vorsichtig gemischt . Die Zellsuspension wurde in 200-~tl-Aliquots auf
vorgekühlte Eppendorfgefäße aufgeteilt und entweder sofort zur Transformation eingesetzt
oder bis zur weiteren Verwendung bei -70°C gelagert .
6 .6 .2 Herstellung kompetenter Zellen nach der Rubidiumchlorid-Methode
Durch eine Rubidiumchlorid-Behandlung erhielten logarithmisch wachsende E. coli-Zellen
die Kompetenz, freie DNA aus dem Medium aufzunehmen . Die Präparation der kompetenten
Zellen erfolgte nach Hanahan (1985) : Einige 2 - 3 mm große Kolonien wurden von einer
frischen LB- oder SOC-Platte in 1 ml SOC resuspendiert . Damit wurden 50 ml SOC-Medium
inokuliert und bis zu einer OD600 von -0,5 bei 37°C und 160 U .p .m inkubiert . Anschließend
wurden die Zellen 10 - 15 min auf Eis abgekühlt und danach geerntet (15 min, 3500 g, 4°C) .
Alle weiteren Schritte wurden auf Eis durchgeführt . Die Zellen wurden vorsichtig in
1/3 Kulturvolumen eiskalter RF1-Lösung (12 g/1 RbCI, 9,9 g/1 MnC12 , 1,5 g/1 CaC12 , 2,9 g/1
Kaliumacetat, 150 g/1 Glycerin, pH 5,8 mit 0,2 N Essigsäure eingestellt) resuspendiert, 15 min
auf Eis inkubiert und erneut abzentrifugiert . Das Zellsediment wurde vorsichtig in
1/12. 5 Kulturvolumen eiskalter RF2-Lösung (2,1 g/1 MOPS, 1,2 g/1 RbCI, 11 g/1 CaC12 , 150 g/1
Glycerin, pH 6,8 mit NaOH eingestellt) resuspendiert und anschließend 15 min auf Eis
inkubiert. Die Zellsuspension wurde in 50-~t1-Aliquots auf vorgekühlte Eppendorfgefäße
verteilt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C gelagert. Auch RbCI-
kompetente Zellen, die direkt zur Transformation verwendet wurden, wurden zunächst
schockgefroren .
6 .6 .3 Herstellung elektrokompetenter Zellen
Zur Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen wurde SOC-Medium (Miller &
Nickoloff, 1995) mit 1 150 Volumen einer Vorkultur inokuliert und bei 37°C und 160 U .p .m .
inkubiert. Beim Erreichen einer OD600 von -0,5 wurden die Zellen zunächst 30 bis 60 min auf
Eis abgekühlt und anschließend geerntet (5 min, 4000 g, 4°C) . Alle weiteren Schritte wurden
auf Eis durchgeführt. Zur Abtrennung von Salzen wurden die Zellen viermal vorsichtig mit