Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

34 MATERIAL UNDMETHODEN
7 .5 .2 MALDI-TOF-Massenspektrometrie
0,5 ~tl der so erhaltenen Peptidlösung wurden auf einer Probenplatte mit 0,5 pul einer
gesättigten Lösung von a-Cyano-4-hydroxy-trans-zimtsäure in 50 % (v/v) ACN, 0,1 % (v/v)
TFA gemischt . Für jede Probe erfolgte eine externe Kalibrierung, bei der die Calibration
Mixtures 1 und 2 des Sequazyme Peptide Mass Standard Kits (Applied Biosystems,
Weiterstadt) unmittelbar neben dem Probenspot aufgetragen wurden . Die Proben wurden in
einer Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation (Applied Biosystems, Weiterstadt) im
positiven Reflektor-Modus mit 20 kV Beschleunigungsspannung, 63 % Gitterspannung und
einer Verzögerungszeit von 125 ns analysiert . Zur Steuerung des Geräts und zur Datenanalyse
wurden die Voyager Control Panel Software 5 .0 und die Voyager Data Explorer Software 3 .5
(Applied Biosystems, Weiterstadt) verwendet . Die erhaltenen Peptidmassen wurden zur
Identifizierung mit dem MS-Fit-Programm (Clauser et al., 1999) analysiert . Eine sichere
Identifizierung wurde angenommen, wenn mindestens vier Peptidmassen mit den
vorhergesagten Massen übereinstimmten . Dabei durften die Unterschiede zwischen
gemessener und theoretischer Masse maximal 100 ppm betragen und die Massenabweichung
der einzelnen Peptide einem Muster folgen, das auf eine ungenaue Kalibrierung zurückgeführt
werden konnte . Wenn die Anzahl der zugeordneten Peptide für eine sichere Identifizierung
des Proteins nicht ausreichend war, wurde versucht, die Proteinlösung durch eine ZipTip-
Behandlung aufzukonzentrieren und vor allem zu entsalzen . Dazu wurde das ZipTip
(Millipore, Schwalbach) zweimal mit 10 pul 50 % (v/v) Acetonitril befeuchtet und
anschließend zweimal mit Äquilibrierungspuffer (0,1 % (v/v) TFA) gewaschen . Danach
wurde die Proteinlösung durch 10maliges Aufziehen und wieder Abgeben an die ZipTip-
Matrix gebunden . Die ZipTips wurden dann fünfmal mit 0,1 % (v/v) TFA gewaschen und die
Proteine anschließend direkt in der Matrixlösung (gesättigte a-Cyano-4-hydroxy-trans-
zimtsäure in 50 % (v/v) Acetonitril, 0,1 % (v/v) TFA) durch fünfmaliges Aufziehen und
wieder Abgeben eluiert . Ein Aliquot wurde direkt auf die MALDI-Proben-Platte aufgetragen
und die Probe nochmals gemessen .