Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

8 EINLEITUNG
Bei anaerobem Wachstum auf Glucose führt E. coli eine gemischte Säuregärung durch, bei
der als Produkte Lactat, Succinat, Acetat, Formiat, Ethanol, C02 und H 2 gebildet werden . Die
Umsetzung von Pyruvat zu Lactat (Pyruvat + NADH + H+ ---> D-Lactat + NAD +) erfolgt in
E. coli durch eine NAD+-abhängige D-Lactat-Dehydrogenase, welche von dem Gen ldhA
kodiert wird . LdhA wird durch eine Kombination aus Anaerobiose und Säure induziert
(Bunch et al ., 1997), ist aber auch unter aeroben Bedingungen vorhanden, wenn auch mit
geringerer Aktivität (Jiang et al., 2001) . LdhA wird allosterisch durch Pyruvat aktiviert
(Pecher et al., 1983 ; Tarmy & Kaplan, 1968b) . Der KmWert für Pyruvat liegt je nach pH-
Wert zwischen 4,4 mM (pH 6,7) und 7,2 mM (pH 7,5) (Tarmy & Kaplan, 1968b) . Pyruvat
stimuliert die Expression des ldhA-Gens zwei- bis vierfach (Jiang et al ., 2001) . E. coli-
Stämme, die Mutationen in den Genen ldhA und pfl haben, können anaerob nicht auf Glucose
oder anderen Zuckern als alleiniger C-Quelle wachsen . Sie benötigen zusätzlich Acetat zum
Wachstum . Einzelmutationen von pfl oder ldhA führen dagegen nicht zu einer Acetat-
Auxotrophie (Mat-Jan et al., 1989) . Bei der Ethanol-Bildung wird das aus Pyruvat gebildete
Acetyl-CoA zunächst zu Acetaldehyd und dieses anschließend zu Ethanol reduziert . Beide
Reaktionen werden von der Alkohol-Dehydrogenase katalysiert, die außerdem auch als
Pyruvat-Formiat-Lyase-Deaktivase wirkt. Die Alkohol-Dehydrogenase wird durch das adhE-
Gen kodiert, das unter anaeroben Bedingungen in Abwesenheit von Nitrat induziert wird
(Membrillo-Hernandez & Lin, 1999) . Succinat entsteht nach Carboxylierung von PEP zu
Oxalacetat (PEP-Carboxylase) durch die Reaktionen der Malat-Dehydrogenase, Fumarase
und Fumarat-Reduktase . C0 2 und H2 werden durch die Formiat-Hydrogen-Lyase aus Formiat
gebildet .
Ziel der Arbeit
Wie oben bereits kurz beschrieben, war das Ziel dieser Arbeit die Charakterisierung und
Optimierung rekombinanter E. coli-Stämme, die Glucose unter aeroben Bedingungen
möglichst vollständig zu Pyruvat umsetzen und dieses ausscheiden . Mit Glucose als einziger
C-Quelle setzt E. coli diese zwar zu 80 - 90 % zu Pyruvat um, das Intermediat wird jedoch
direkt weiter verstoffwechselt (siehe Abb . 4) . Um aus E. coli einen effizienten Pyruvat-
Produzenten zu machen, muss in erster Linie die oxidative Decarboxylierung des Pyruvats
blockiert werden. Ein Stamm, der aufgrund seines Genotyps genau diese gewünschte
Eigenschaft aufweisen sollte, wurde in der Literatur bereits beschrieben, nämlich E. coli