Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

ERGEBNISSE 7 1
auf LB-Platten mit 15 lag/ml Kanamycin und 80 mM Fluoropyruvat (hemmt das Wachstum
von MG1655 vollständig) . Dabei konnten -150 bzw . 1000 Klone erhalten werden, was
zeigt, dass die Selektion prinzipiell möglich ist . Die erhaltenen Klone wurden auf Glucose-
Minimalmedium-Platten (50 mM Glucose) mit 15 lag/ml Kanamycin ausgestrichen . Die
Klone, die auf LB mit Bromopyruvat wuchsen, zeigten wiederum kein Wachstum auf
Glucose-Minimalmedium Von den -400 getesteten Klonen, die auf LB mit Fluoropyruvat
selektioniert worden waren, wuchsen etwa 90 % auf Glucose-Minimalmedium mit
Kanamycin. Diese Klone wurden anschließend auf Pyruvat-Minimalmedium (50 MM)
überimpft . Klone, die nicht auf Pyruvat-Minimalmedium, aber auf Glucose-Minimalmedium
sowie auf LB-Medium mit Fluoropyruvat wachsen, könnten einen Defekt im Pyruvat-Import
haben . Es zeigte sich, dass 8 Klone einen deutlichen Wachstumsdefekt auf Pyruvat-
Minimalmedium-Platten hatten . Bei den so erhaltenen Klonen wurde untersucht, ob sie
Pyruvat verstoffwechseln können . Es zeigte sich allerdings, dass alle Klone in einem Glucose-
Minimalmedium mit Pyruvat beide Substanzen umsetzen konnten und damit auch in der Lage
waren, Pyruvat aufzunehmen . Da die Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden kann, dass der
Pyruvat-Transporter speziell bei Wachstum auf Glucose essentiell ist, sollte bei weiteren
Experimenten vielleicht eine Selektionierung auf Lactat-Minimalmedium-Platten erfolgen.
7 Vergleichende Transkriptom-Analyse durch DNA-Chips
Durch Transkriptomanalysen mit DNA-Microarrays sollte untersucht werden, welchen
spezifischen Einfluss die Pyruvat-Produktion auf die genomweite Genexpression in E. coli
YYC202 besitzt, welche Unterschiede es in der Genexpression von YYC202 und dem
Wildtyp MG1655 gibt (stamm- und pyruvatspezifische Unterschiede) und welche
Unterschiede es in der Genexpression eines modifizierten YYC202-Stammes, der nicht mehr
Pyruvat produziert, und MG1655 gibt (stammspezifische Unterschiede) . Im Anhang ist eine
Zusammenstellung aller mRNA-Level von Genen, die in einem dieser Experimente einen
veränderten mRNA-Level aufwiesen, enthalten. Diese Liste wurde mit den relativen mRNA-
Leveln der anderen Experimenten ergänzt (Tab . 24) . Darüber hinaus wurde analysiert,
welchen Einfluss ein Pyruvat-Puls auf die Genexpression von MG1655 hat .
Für den Vergleich genomweiter Genexpressionsmuster wurden fluoreszenzmarkierte
cDNA-Sonden der zu vergleichenden RNA-Proben synthetisiert (Wendisch et al., 2001) .
Dabei wurde eine Probe mit einem grünen Fluoreszenzfarbstoff (Cy3), die andere Probe mit
einem roten Fluoreszenzfarbstoff (Cy5) markiert . Zur Bestimmung relativer mRNA-Spiegel