Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

32 MATERIAL UNDMETHODEN
Proteinlösung wurden die Ansätze 30 min bei 37°C inkubiert und vor der Messung der
Extinktion bei 562 nm 10 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt .
7 .4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen
7 .4 .1 Zweidimensionale Gelelektrophorese von Proteinen
Bei der zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D-Elektrophorese) werden
Proteingemische zunächst durch eine isoelektrische Fokussierung nach ihrem isoelektrischen
Punkt (1 . Dimension) und anschließend durch SDS-PAGE nach ihrer Größe (2 . Dimension)
aufgetrennt . Mit Ausnahme von Thioharnstoff (Sigma, Deisendorf) und des Proteinstandards
(New England Biolabs, Schwalbach) wurden alle Reagenzien und Apparaturen für die 2D-
Elektrophorese von Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) bezogen . Vor der
isoelektrischen Fokussierung in einem immobilisierten pH-Gradienten (IPG) wurden die
Proteine solubilisiert. Dazu wurden 300 lag Protein vakuumgetrocknet und in 350 ~t1
Solubilisierungspuffer (9 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 100 mM Dithiothreitol, 2 % (w/v)
CHAPS, 1 % (v/v) Pharmalyte 3-10) gelöst . Die Proteinlösung wurde dann auf einem 18 cm
langen IPG-Streifen verteilt, der den pH-Bereich von 4 bis 7 abdeckte . Die isoelektrische
Fokussierung wurde in einem IPGphor-Gerät nach folgendem Programm durchgeführt : 6 h
30 V, 6 h 60 V, 1 h 200 V, 1 h 500 V, 1 h 2000 V, -10 h 8000 V (ergibt in der Summe
80000 Voltstunden) . Nach der 1 . Dimension konnte der IPG-Streifen bis zur weiteren
Verwendung bei -20°C gelagert werden .
Der IPG-Streifen wurde nach der 1 . Dimension unter leichtem Schwenken zunächst 20 min
in 10 ml Äquilibrierungslösung I (Äquilibrierungs-Stammlösung (50 mM Tris-HCl pH 6,8,
6 M Harnstoff, 30 % (v/v) Glycerin, 4 % (w/v) SDS), 1 % (w/v) DTT, 50 pul BPB-Lösung
(0,1 g Bromphenolblau/ml, 50 % (w/v) Saccharose) und anschließend 20 min in
Äquilibrierungslösung II (Äquilibrierungs-Stammlösung, 4 % (w/v) Iodacetamid, 50 ~t1 BPB-
Lösung) inkubiert. DTT und Iodacetamid wurden direkt vor der Anwendung zugesetzt .
Die Auftrennung nach Größe erfolgte mit einem Fertiggel (ExcelGel SDS Gradient XL 12-
14 %, Trennungsbereich ca. 5 bis 210 kDa) unter Verwendung des Horizontalgel-Systems
Multiphor II . Zur Vorbereitung wurde die Kühlplatte dünn mit Cover-Fluid bedeckt und das
Gel luftblasenfrei auf die Kühlplatte aufgelegt. Die ExcelGel°SDS-Pufferstreifen wurden
ebenfalls luftblasenfrei am Anoden- bzw . Kathoden-Ende des Gels aufgelegt . Der IPG-
Streifen wurde nach Äquilibrierung mit Lösung 11 kurz mit Wasser gespült, auf die Kathoden-