Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

50 ERGEBNISSE
3 Versuche zur Glucose-Umsetzung mit Zellsuspensionen von E. coli YYC202
3.1 Einfluss des pH-Wertes auf die Pyruvat-Bildung durch Zellsuspensionen
Bei Wachstum von E. coli in Glucose-Minimalmedium werden circa 50 % der verbrauchten
Glucose für die Biosynthese von neuem Zellmaterial verwendet (Holms, 1996) . Eine
maximale Pyruvat-Ausbeute, d.h . 2 Mol Pyruvat/Mol Glucose, ist also nur mit nicht-
wachsenden Zellen möglich . Daher erfolgte neben der Charakterisierung von wachsenden
YYC202-Zellen auch die Untersuchung von Zellsuspensionen (nicht-wachsende, aber
metabolisch aktive Zellen) . Zu diesem Zweck wurden Zellen, die in Minimalmedium mit
Glucose und Acetat kultiviert worden waren, in einem Puffer mit Glucose resuspendiert, der
weder Acetat noch weitere Nährstoffe, wie z.B . Stickstoff- und Schwefelquellen, enthielt .
Zunächst wurde der Einfluss verschiedener Puffersubstanzen auf Glucose-Verbrauch und
Pyruvat-Bildung durch Zellsuspensionen getestet . Dabei wurde 100 mM Kaliumphosphat-
Puffer pH 7, MOPS-Puffer pH 7 (mit Na0H eingestellt) und Tris-Puffer pH 7 (mit HCl
eingestellt) mit jeweils 10 mM Glucose eingesetzt, die OD600 betrug jeweils etwa 1 . In MOPS
und Phosphat-Puffer wurden Ausbeuten von 1,8 und 1,4 Mol Pyruvat/Mol Glucose erreicht,
in Tris-Puffer dagegen nur 0,6 Mol Pyruvat/Mol Glucose . Ursache für diese Diskrepanz war
der pH-Wert, der im Fall von MOPS und Phosphat konstant bei 7 blieb, während er bei Tris
auf 6 sank. Daher wurde in einem weiteren Versuch die Abhängigkeit der Glucose-
Umsetzung vom pH-Wert getestet . Um einen Einfluss der Puffersubstanz auszuschließen,
wurde in diesem Fall ein Puffergemisch bestehend aus 50 mM MES (pKa = 6,15), 50 mM
MOPS (pKa = 7,2) und 50 mM TRICINE (pKa = 8,12) verwendet, dass auf pH-Werte von 6,0,
6,5, 7,0, 7,5 und 8,0 eingestellt wurde . Dem Puffergemisch wurde 10 mM Glucose zugesetzt
und die YYC202-Zellen zu einer OD600 von circa 1 resuspendiert .
Tab . 10 zeigt, dass die Glucose-Umsetzung durch Zellsuspensionen von YYC202 pH-
abhängig war . Bei pH >7 sank die Pyruvat-Ausbeute deutlich, während sie im Bereich von
pH 6 - 7 konstant blieb . Es konnte allerdings nicht festgestellt werden, was aus der Glucose
entsteht, die nicht zu Pyruvat umgesetzt wurde . Durch HPLC-Analytik konnte nur festgestellt
werden, dass keine weiteren organischen Säuren, wie Lactat gebildet wurden . Es konnte
bestätigt werden, dass Zellsuspensionen höhere Ausbeuten als wachsende Zellen lieferten .
Unter optimalen Bedingungen (pH 7) konnte sogar eine fast vollständige Umsetzung der
eingesetzten Glucose zu Pyruvat erzielt werden (Abb . 12) .