Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

MATERIAL UND METHODEN 19
Vergleich mit einer Eichgerade (0,1 mM - 10 mM) . Routinemäßig wurde bei jeder Serie von
HPLC-Läufen ein Standard-Mix aus Pyruvat, Lactat, Succinat und Acetat (jeweils 1 mM)
gemessen, um Abweichungen und Schwankungen innerhalb einer Serie zu berücksichtigen .
Es wurde darauf geachtet, dass die gemessenen Konzentrationen nie größer als 10 mM waren .
Tab . 7 : Retentionszeiten verschiedener organischer Säuren bei Auftrennung auf einer Aminex
HPX87H-Säule (150 x 7,8 mm bzw . 300 x 7,8 mm, BioRad, München) unter Verwendung folgender
Parameter : mobile Phase 6 mM H2S04 , Fluß : 0,6 ml/min, Säulentemperatur : 65C, Injekti onsvolumen :
50 pl ; n.b . = nicht bestimmt .
Substanz Retentionszeit 150-mm-Säule Retentionszeit 300-mm-Säule
Oxalacetat 3,68 ± 0,05 n .b .
Citrat/Isocitrat 4,34 ± 0,05 n .b .
a-Ketoglutarat 4,47 ± 0,05 n .b .
Pyruvat 5,10 ± 0,05 9,40 ± 0,1
Succinat 6,21 ± 0,05 11,64 ± 0,1
Lactat 6,80 ± 0,05 12,64 ± 0,1
Fumarat 7,42 ± 0,05 n .b .
Acetat 8,05 ± 0,05 14,85 ± 0,1
6 Mikrobiologische und molekularbiologische Methoden
6 .1 DNA-Isolierung
6 .1 .1 Isolierung von Plasmid-DNA
Die Isolierung und Reinigung von Plasmiden aus E. coli erfolgte im kleinen Maßstab
(ausgehend von 5 ml Übernachtkultur) mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep-Kits der Firma
Qiagen (Hilden), das auf der alkalischen Lyse nach Birnboim und Doly (1979) beruht . Die
Isolierung von Plasmiden im größeren Maßstab erfolgte mit Hilfe des Qiagen Plasmid Midi-
Kits (ausgehend von 100 ml ÜN-Kultur) bzw . des Qiagen Plasmid Maxi-Kits (ausgehend von
500 ml ÜN-Kultur) nach den Angaben des Herstellers . Die Plasmid-DNA wurde in TE-Puffer
(10 mM Tris-HCI pH 7,9, 1 mM EDTA) oder in Wasser eluiert bzw . gelöst. Die mit dieser
Methode gewonnene Plasmid-DNA konnte außer für Restriktionsanalysen und
Transformationen auch direkt zur Sequenzierung eingesetzt werden .