Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

MATERIAL UND METHODEN 27
mit Chloramphenicol (20 ~tg/ml) bei 43°C ausplattiert . Da pK03 und seine Derivate bei 43°C
in E. coli nicht repliziert werden, sollte in chloramphenicolresistenten Klonen das Plasmid
über homologe Rekombination im Bereich des Deletionskonstrukts in das Chromosom
integriert worden sein . Um auf ein zweites Rekombinationsereignis zu selektionieren, wurden
chloramphenicolresistente Klone in je 1 ml LB-Medium aufgenommen und sofort auf LB-
Medium mit 5 % (w/v) Saccharose ausplattiert und bei 30°C inkubiert . In Anwesenheit von
Levansucrase, dem Produkt des sacB-Gens von pK03, sind 5 % Saccharose letal für E. coli .
Deshalb sollte bei saccharoseresistenten Klonen das Plasmid durch ein zweites
Rekombinationsereignis aus dem Chromosom entfernt worden sein, wobei entweder der
Wildtyp wiederhergestellt oder die gewünschte Deletion erzeugt wird .
6 .9 Plvir-Phagentransduktion
Zur Plvir-Phagentransduktion wurde ein Protokoll von Silhavy et al. (1984) modifiziert .
6 .9 .1 Herstellung des Phagenlysates
Der Donor-Stamm wurde in 5 ml LB mit 0,2 % (w/v) Glucose und 5 mM CaC1 2 bis zu einer
OD600 von -1 bei 37°C kultiviert. 1/100 der Vorkultur wurde in 5 ml LB mit 0,2 % (w/v)
Glucose und 5 mM CaC12 inokuliert und bis zu einer OD600 von -0,4 bei 37°C und
170 U .p.m . inkubiert . Anschließend wurde entweder ein einzelner Phagenplaque oder 100 ~tl
des Plvir-Lysates (>5 x 10 8 Phagen/ml) zugesetzt und etwa zwei Stunden bei 37°C inkubiert,
bis die Zellen vollständig lysiert waren . Zum Abstoppen der Lyse wurden 100 ~t1 Chloroform
zugefügt, der Ansatz gut gemischt und 10 min bei 4500 g zentrifugiert . Der das Phagenlysat
enthaltende wässrige Überstand wurde sterilfiltriert und konnte bei 4°C gelagert werden .
6 .9 .2 Bestimmung des Phagentiters
Der Empfänger-Stamm wurde in 5 ml LB mit 0,2 % (w/v) Glucose und 5 mM CaC12 bis zu
einer OD600 von -0,5 - 1 bei 37°C kultiviert und anschließend 10 min bei 1500 g sedimentiert .
Das Pellet wurde in 1 ml 0,1 M MgS04/5 mM CaC12 resuspendiert . Jeweils 50 ~t1
Zellsuspension wurde mit 50 ~tl verdünntem Phagenlysat (10 -2-10-10) gemischt und 5 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde 300 ~tl geschmolzener, auf 50°C abgekühlter
R-Top-Agar (10 g/1 Trypton, 1 g/1 Hefeextrakt, 8 g/1 NaCI, 2 mM CaC12, 1 g/1 Glucose, 8 g/1
Agar) hinzugefügt, gemischt und sofort auf R-Platten (wie R-Top-Agar, aber mit 15 g/1 Agar)