Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...
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ERGEBNISSE 41<br />
IV ERGEBNISSE<br />
1 Charakterisierung des <strong>acetatauxotrophe</strong>n Escherichia coli-Stammes YYC202<br />
Ziel dieser Arbeit war die Konstruktion und Charakterisierung von rekombinanten<br />
Escherichia coli-Stämmen, die Glucose möglichst effizient in <strong>Pyruvat</strong> umsetzen und diese<br />
Verbindung dann ins Medium ausscheiden . <strong>Pyruvat</strong> ist in eine Vielzahl von katabolen und<br />
anabolen Stoffwechselwegen involviert, z.B . Glykolyse, Gluconeogenese, Amino-<br />
säurebiosynthesen etc ., und daher ein zentrales Intermediat im zellulären Stoffwechsel .<br />
Glucose wird von E. coli über das PEP-abhängige Phosphotransferase-System (PTS-System)<br />
in die Zelle aufgenommen und zu 80-90 % in der Glykolyse zu <strong>Pyruvat</strong> umgesetzt . Dieses<br />
wird dann einerseits für Biosynthesen eingesetzt, der überwiegende Teil wird jedoch unter<br />
aeroben Bedingungen <strong>durch</strong> den <strong>Pyruvat</strong>-Dehydrogenase-Komplex zu Acetyl-CoA oxidiert,<br />
das dann seinerseits entweder im Citratzyklus zu C0 2 oxidiert oder für Biosynthesen<br />
verwendet wird . Außer <strong>durch</strong> den <strong>Pyruvat</strong>-Dehydrogenase-Komplex kann <strong>Pyruvat</strong> auch <strong>durch</strong><br />
die <strong>Pyruvat</strong>-Oxidase (<strong>Pyruvat</strong>-Chinon-Oxidoreduktase) zu Acetat und C02 oxidiert werden,<br />
wobei die Elektronen auf Ubichinon und nicht auf NAD+ übertragen werden . Um also aus<br />
E. coli einen effizienten <strong>Pyruvat</strong>-Produzenten zu machen, muss in erster Linie die oxidative<br />
Decarboxylierung des <strong>Pyruvat</strong>s blockiert werden . Ein Stamm, der aufgrund seines Genotyps<br />
genau diese gewünschte Eigenschaft aufweisen sollte, wurde in der Literatur bereits<br />
beschrieben, nämlich E. coli YYC202 (Georgiou et al ., 1987) . Dieser Stamm besitzt eine<br />
Deletion der aceEF-Gene, die für die <strong>Pyruvat</strong>-Decarboxylase- und die<br />
Dihydrolipoyltransacetylase-Komponente des <strong>Pyruvat</strong>-Dehydrogenase-Komplexes kodieren,<br />
sowie weitere Mutationen in den Genen für die <strong>Pyruvat</strong>-Oxidase (kodiert <strong>durch</strong> poxB), für die<br />
<strong>Pyruvat</strong>-Formiat-Lyase (kodiert <strong>durch</strong> pflB) und für die Phosphoenolpyruvat-Synthetase<br />
(kodiert <strong>durch</strong> pps), die zum Verlust der entsprechenden Enzymaktivitäten führen . Aufgrund<br />
dieses Genotyps (DaceEF pfl-1 poxB1 pps-4 rpsL zbi : :Tn10) sollte E. coli YYC202 <strong>Pyruvat</strong><br />
nicht mehr zu Acetyl-CoA bzw . Acetat umsetzen können und bei Wachstum auf Glucose-<br />
Minimalmedium Acetat benötigen .
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