Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

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ERGEBNISSE 57 und Co-1dhA-S) als Sonde wurde in EcoRFHindlll-verdauter chromosomaler DNA des Ausgangsstammes YYC202 erwartungsgemäß nur ein einziges Fragment von 11 kb Länge nachgewiesen. In EcoRI/Hindlll-verdauter chromosomaler DNA des Donorstammes NZN117 und von YYC202ldhA wurden dagegen zwei Fragmente von 6,2 kb und 6,8 kb Länge detektiert, da in diesen Stämmen <strong>durch</strong> die Insertion der Kanamycin-Kassette in ldhA eine HindIII-Schnittstelle hinzugefügt wurde . Mit einem DIG-markierten 0,7-kb-Fragment des Kanamycin-Resistenzgens aus NZN117 (entspricht dem PCR-Produkt mit den Primern KAN- for 1 .1 und KAN-rev 2 .1) wurde erwartungsgemäß kein Signal in YYC202 nachgewiesen, in YYC202ldhA und NZN117 dagegen konnten wiederum Fragmente von 6,2 kb und 6,8 kb Länge detektiert werden . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 bp - 21226 9416 6557 5000 4100 3530 - 2322 - 2000 - 1584 Abb. 16 : Southern-Blot-Analyse (Southern, 1975) von YYC2021dhA (siehe vorherige Seite) . Die Spuren 1, 5, 6 und 10 enthalten je 75 ng DIG-markierten DNA-Standard II und III (Roche Diagnostics) . Die Spuren 2 und 7 enthalten chromosomale DNA von YYC202, die Spuren 3 und 8 chromosomale DNA von YYC2021dhA und die Spuren 4 und 9 chromosomale DNA von NZN117 . Pro Spur wurden jeweils 15 gg chromosomale DNA aufgetragen, die mit EcoR1 und Hindlll verdaut worden war . Die DNA-Fragmente wurden auf einem 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt und nach Denaturierung auf eine Nylon-Membran geblottet . Der Blot mit den Spuren 1-5 wurde mit einem DIG-markierten 668-bp- Fragment des Kanamycin-Resistenzgens aus NZN117 hybridisiert, der Blot mit den Spuren 6-10 mit einem DIG-markierten 2153-bp-DNA-Fragment des IdhA-Gens . Zur phänotypischen Charakterisierung der ldhA-Mutante wurde zunächst die NAD +- abhängige Lactat-DH-Aktivität (LdhA-Aktivität) von YYC202 und YYC202ldhA nach 6- stündiger Kultivierung in LB-Medium mit 0,4 % (w/v) Glucose bestimmt . Dazu wurden
58 ERGEBNISSE zellfreie Extrakte hergestellt, die Membranfraktion <strong>durch</strong> Ultrazentrifugation entfernt und die lösliche Fraktion in einen Enzymtest eingesetzt, bei dem die pyruvatabhängige Oxidation von NADH zu NAD + photometrisch anhand der Abnahme der Extinktion bei 340 nm gemessen wurde (Bunch et al., 1997) . Mit diesem Test wurde ermittelt, dass der Stamm YYC202 eine hohe LdhA-Aktivität von etwa 3 ~tmol min' (mg Protein) -1 besitzt, während YYC202ldhA erwartungsgemäß praktische keine LdhA-Aktivität mehr aufwies (
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