Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

68 ERGEBNISSE
dieser Daten keine Schlussfolgerung bezüglich der Apfl-Abhängigkeit des Pyruvat-Exports
gemacht werden .
6 .3 Auswirkung einer acrAB-Mutation auf die Pyruvat-Produktion
Um zu untersuchen, ob Pyruvat durch das Multidrug-Efflux-System AcrAB-To1C
transportiert wird, wurde eine acrAB Mutation mittels Plvir Transduktion (Silhavy et al.,
1984) im Pyruvat-Produzenten YYC202 eingeführt . Als Donor wurde dabei E. coli JZM120
(Ma et al., 1995) verwendet. In diesem Stamm ist der größte Bereich von acrAB deletiert und
durch das KanR-Gen aus dem Transposon Tn903 ersetzt worden . Der Austausch der Wildtyp-
Gene acrAB in YYC202 gegen AacrAB : :Kan wurde mittels PCR überprüft (Abb . 22) . Mit
den Primern acrAB-for2 und acrAB-rev2 (Tab . 3) und chromosomaler DNA von E. coli
YYC202 wurde wie erwartet ein 3,3 kb großes Fragment amplifiziert (Abb . 22, Spur 1), mit
chromosomaler DNA von YYC202AacrAB: :Kan dagegen ein 1,7-kb-Fragment (Abb . 22,
Spur 2) . Damit wurde die erfolgreiche Transduktion bestätigt .
Versuche zur Pyruvat-Produktion mit wachsenden Kulturen der Stämme YYC202,
YYC202ldhA und YYC202AacrAB : :kan ergaben, dass YYC202AacrAB: :kan keine
veränderte Pyruvat-Produktion aufwies . Die Ausbeuten lagen für YYC202 bei 1,7, für
YYC202ldhA bei 1,9 sowie für YYC202AacrAB::kan bei 1,8 Mol Pyruvat/Mol Glucose .
Demnach wird der Transport von Pyruvat nicht durch das Multidrug-Efflux-System AcrAB-
TolC vermittelt . M1 M2 1 2
3000
2500
.. .. . . . .. .. .. . . . .. .. . . . . . .. . . . .
2000
1500
1000
Abb . 22 : 1 %-iges Agarosegel zur Überprüfung der acrAB Mutation . Es wurden folgende Proben
aufgetragen : 1-kb-DNA-Standard von Promega (Spur M1), (II + 111)-Standard von Roche (Spur M2),
acrAB-PCR-Produkt des Ausgangstammes YYC202 (Spur 1) und acrAB ::Kan-PCR-Produkt von
YYC202acrAB ::Kan (Spur 2) . Als Primer wurden jeweils acrAB-for2 und acrAB-rev2 verwendet (siehe
Tab . 3) .