Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

MATERIAL UND METHODEN 37
wurde im Institut für Biotechnologie durch Dr. Volker Wendisch und Dr. Tino Polen etabliert
(Lehnen et al., 2002 ; Polen, 2002 ; Wendisch et al ., 2001) . Die in dieser Arbeit verwendeten
DNA-Chips wurden von Tino Polen zur Verfügung gestellt . Sie enthielten 4108 (95,8 %) aller
4290 ORF's von E. coli MG1655 . Da man zur Herstellung von E. coli-Genom-DNA-Chips
PCR-Produkte jedes E. coli-Gens in ausreichender Menge benötigt, wurden ausgehend von
genomischer E. coli MG1655-DNA als Template die Gene/ORFs von E. coli MG1655
(Blattner et al., 1997) durch PCR mit spezifischen Primerpaaren (ORFmer Primer Set,
Genosys Biotechnologies, Cambridgeshire, England) amplifiziert (Richmond et al ., 1999) .
Für die spätere Immobilisierung von DNA wurden die DNA-Chip-Glasobjektträger zunächst
mit Poly-L-Lysin beschichtet (Shalon et al ., 1996 ; Zimmer et al., 2000) . Anschließend
erfolgte mit Hilfe eines computergesteuerten Robotersystems die Auftragung der PCR-
Produkte (150-300 ng/pul) auf eine Fläche von 2 cm x 2 cm auf den Objektträger (siehe auch
http://cmgm .stanford .edu/pbrown/mguide/ ) . Dabei wurden etwa 0,1 - 1 nl PCR-Produkt pro
Spot aufgetragen . Die Spots hatten eine Durchmesser von etwa 60 - 120 ~tm . Außer den PCR-
Produkten der amplifizierten E. coli-Gene wurden zusätzlich Hybridisierungskontrollen (X-
DNA und PCR-Produkte von Genen aus Corynebacterium glutamicum) und für die
Datennormalisierung (siehe 8 .4) genomische E. coli-DNA an verschiedenen Stellen mehrmals
auf dem Chip angeordnet .
Um in Hybridisierungsexperimenten eine gleichmäßigere Verteilung der
Fluoreszenzintensitäten innerhalb der Spot-Fläche zu erzielen, wurden die DNA-Chips im
ersten Schritt der Nachbehandlung durch Inkubation in einer Feuchtigkeitskammer (Sigma,
Deisendorf) über der Oberfläche einer 1 x SSC-Lösung inkubiert (100 ml, 15 min) . Da die
aufgetragene DNA zur Herstellung der DNA-Chips ursprünglich in 3 x SSC-Lösung gelöst
vorlag, zieht das getrocknete Salz und die DNA innerhalb jeder Spot-Fläche Wasser aus der
umgebenden feuchten Kammerluft an . Die Spots auf den DNA-Chips wurden so
rehydratisiert, was an der Bildung von die Spot-Fläche umspannenden Wassertröpfchen zu
erkennen war . Während der Inkubation (15 min) verteilen sich infolge der Brown'schen
Molekularbewegung die DNA-Moleküle, deren negativ geladene Phosphatreste noch nicht
ausreichend durch die positiv geladenen F--Aminogruppen der Poly-L-Lysin-Seitenketten
fixiert wurden . Zur Fixierung der DNA-Moleküle auf der Oberfläche erfolgte nach dem
Rehydratisieren eine Blitztrocknung für fünf Sekunden bei 100°C (Shalon et al ., 1996) .
Danach wurde die DNA durch UV-Bestrahlung (650 ~J, UVStratalinker, Stratagene) erneut
auf den Objektträger immobilisiert . Zum Blocken der freien Poly-L-Lysin beschichteten
Oberfläche, die nicht mitDNA bedeckt war, erfolgte eine 25minütige Inkubation in 2-Methyl-