Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

24 MATERIAL UNDMETHODEN
400 ml eiskaltem 10 %-igem (v/v) Glycerin gewaschen . Bei jedem Waschschritt wurde die
zur Sedimentation eingesetzte Zentrifugalbeschleunigung um jeweils 500 g erhöht .
Anschließend wurden die Zellen in 1 /400 Kulturvolumen 10 %-igem (v/v) Glycerin
aufgenommen, in 50-~tl- Aliquots auf vorgekühlte Eppendorfgefäße verteilt, in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bei -70°C gelagert .
6 .6 .4 Ligation
Um die 5'-Phosphat-Gruppe von verdauten Plasmiden ("Vektoren") abzuspalten, wurde
eine Dephosphorylierung mit Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP, Roche Diagnostics,
Mannheim) durchgeführt. Die Dephosphorylierung erfolgte nach der Restriktion (0,5 bis 3 lag
DNA in 50 ~tl) durch Zugabe von 1 ~tl SAP (1 U) . Es folgte eine 45- bis höchstens 60-
minütige Inkubation bei 37°C . Der dephosphorylierte "Vektor" wurde ebenso wie das "Insert"
(Restriktionsfragmente von Plasmiden oder PCR-Produkte) aus einem Agarosegel isoliert .
Für Ligationen wurde der Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) genutzt,
wobei die Ligationszeit 10 - 20 min bei Raumtemperatur betrug . Dephosphorylierte Vektor-
DNA und Insert-DNA wurden in einem molaren Verhältnis von etwa 1 :3 gemischt .
6 .6 .5 Transformation von E. coli
Zur Transformation mit Ligationsansätzen oder Plasmiden wurden CaC12-kompetente-
(siehe 6 .6 .1) oder RbCI-kompetente-Zellen (siehe 6 .6 .2) verwendet . Dazu wurden frische
kompetente Zellen verwendet (nur CaC1 2-kompetente-Zellen) oder die bei -70°C gelagerten
Aliquots auf Eis aufgetaut. 1 ~t1 Plasmid-DNA oder bis zu 5 ~t1 eines Ligationsansatzes
wurden mit 50 ~t1 Zellsuspension gemischt und 30 min auf Eis inkubiert . Anschließend
erfolgte ein Hitzeschock von 45 sec bei 42°C, gefolgt von 2 min Inkubation auf Eis . Dann
wurden 500 ~tl SOC-Medium (siehe 5 .1) zugegeben und der Ansatz 1 h bei 37°C inkubiert
("phänotypische Expression") . Anschließend wurden Aliquots auf LB-Platten ausplattiert, die
das geeignete Antibiotikum enthielten und die Platten ÜN bei 37°C inkubiert.
Zur Transformation intakter Plasmide und für die Transposonmutagenese mit pKNG101-
Tn5 wurden elektrokompetente Zellen eingesetzt (siehe 6 .6 .5) . 50 ~tl Zellsuspension wurde
mit bis zu 5 ~t1 DNA gemischt und luftblasenfrei in eine eisgekühlte Elektroporationsküvette
(0,2 cm Elektronenabstand, Eppendorf, Hamburg) überführt . Anschließend erfolgte sofort ein
Strompuls mit folgenden Parametern : Spannung : 2,5 kV, Kapazität : 25 ~tF, Widerstand :
200 S2 . Die Zeitkonstante lag dabei zwischen 4,7 und 4,9 ms . Dann wurden 500 ~t1
vorgewärmtes SOC-Medium (siehe 5 .1) zugegeben und der Ansatz 1 h bei 37°C inkubiert