Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

MATERIAL UND METHODEN 39
8 .4 Auswertung von DNA-Chips
Zur Bestimmung relativer mRNA-Spiegel wurde die Cy3- und Cy5-Fluoreszenz der Spots
gemessen . Das Verhältnis von Cy3- und Cy5-Fluoreszenz eines Spots korreliert direkt mit
dem Verhältnis der Anzahl der mRNA-Moleküle in den verglichenen RNA-Proben (Shalon
et al ., 1996) . Die DNA-Chips wurden unter Verwendung des Axon GenePix 4000A Laser-
Scanners und der GenePix Pro 3 .0 Software (Axon Inc ., Union City, USA) ausgewertet . Der
Laser-Scanner bestrahlt die DNA-Chip-Oberfläche mit monochromatischem Licht von
532 nm (Anregung von Cy3-dUTP) und 635 nm (Anregung von Cy5-dUTP) und registriert
die daraufhin emittierte Cy3-Fluoreszens bei 570 nm und die Cy5-Fluoreszenz bei 670 nm
mit lichtempfindlichen Kathoden . Diese wandeln die Cy3- und Cy5-Fluoreszenz in
elektrischen Strom um, der weiter verstärkt wird . Die gemessene Stromstärke korreliert direkt
mit der Cy3- bzw . Cy5-Fluoreszenz . Mit Hilfe der Software wurde die ortsaufgelöste
Information für die Cy3- und Cy5-Fluoreszenz anhand der numerischen Werte als
Fluorogramm bildlich dargestellt und im 16-bit-TIFF-Format elektronisch gespeichert .
Hierdurch wurden die Roh-Fluoreszenz-Daten erhalten . Die 'GenePix Array List' (erstellt
von T. Polen) erlaubte eine Zuordnung jedes einzelnen detektierten DNA-Spots zu dem
entsprechenden E. coli-Gen bzw . zu den entsprechenden Hybridisierungskontrollen
(genomische E. coli-DNA, ;,-DNA und PCR-Produkte von Genen aus Corynebacterium
glutamicum) . Die Daten wurden anschließend nach folgendem Schema analysiert : Zunächst
erfolgte eine Berechnung des Signal zu Rausch-Verhältnisses für Cy3- und Cy5-
Fluoreszenzsignale durch Bildung des Quotienten Signalintensität spot/Signal-
intensitätspoti,;nterr,na. Wenn das Signal/Rausch-Verhältnis für die Cy3- und die Cy5-
Fluoreszenz kleiner als drei war, wurden die Signale als zu schwach angenommen, um
zuverlässig ausgewertet werden zu können und in weiteren Analysen nicht berücksichtigt
(Khodursky et al., 2000) . Um die durch die Cy5-/Cy3-Fluoreszenz-Verhältnisse
repräsentierten relativen mRNA-Spiegel verschiedener DNA-Chip-Experimente besser
miteinander vergleichen zu können, wurden die Werte normalisiert (Eisen et al ., 1998) . Die
Normalisierung der Ergebnisse erfolgte für jeden DNA-Chip anhand des Cy5-/Cy3-
Fluoreszenz-Verhältnisses, das bei Hybridisierung der Sonden mit chromosomaler DNA von
E. coli MG1655 gemessen wurde und gleich 1 sein sollte (Eisen et al., 1998) . Es wurde der
Korrekturfaktor ermittelt, der bei Multiplikation mit dem experimentellen Ergebnis ein
Verhältnis von 1 für die chromosomale DNA ergab und die Verhältnisse aller genspezifischen
Spots wurden dann mit diesem Faktor multipliziert (Khodursky et al., 2000) . Für die im