Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

1 8 MATERIAL UNDMETHODEN
(Bergmeyer, 1985) . Die Extinktion vor Zugabe der LDH entspricht der zugesetzten NADH-
Konzentration . Die Abnahme der NADH-Konzentration wurde photometrisch bei 340 nm mit
einem Mikrotiterplatten-Photometer gemessen
Konzentration . Das Protokoll wurde, wie
Mikrotiterplattenansatz angepasst. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte anhand einer
Eichgerade aus 8 Pyruvat-Standards (0,005 - 0,15 mM), die für jede Mikrotiterplatten-
Messung neu erstellt wurde .
und war proportional zur Pyruvat-
in Tab . 6 angegeben, für einen
Tab . 6: Testansatz für die Bestimmung der Pyruvat-Konzentration im Mikrotiterplattenansatz . Der
Ansatz wurde 100 Minuten bei Raumtemperatur schüttelnd inkubiert.
Lösung Volumen Endkonzentration im Test
Triethanolamin-Puffer
NADH-Lösung (5 mM)
Probe bzw . Standard
Bestimmung des Nullwertes bei 340 nm
125 pul
15 p,l
125 p,l
5 .4 Bestimmung der Konzentration organischer Säuren
0,25M
0,28 mM
0,005 -0,15 mM
L-LDH 8,6 pul 0,424 U
Der qualitative und quantitative Nachweis organischer Säuren (a-Ketoglutarat, Acetat,
Citrat/Isocitrat, Fumarat, Lactat, Pyruvat, Succinat, Oxalacetat) in Kulturüberständen erfolgte
mit dem D-7000 HPLC-System von Merck Hitachi (UV-Detektor L7400, Säulenofen L7350,
Probengeber L7200, Pumpe L7100, Computerschnittstelle D7000) . Die Probenauftrennung
erfolgte isokratisch (0,6 ml/min) über eine Aminex-Säule (HPX-87H, 150 x 7,8 mm oder
alternativ 300 x 7,8 mm, BioRad, München) bei 65°C . Bei den verwendeten Säulen handelte
es sich um Kationenaustauschsäulen, die mit Protonen belegt waren, so dass die Auftrennung
auf dem lonenausschlussprinzip basierte . Als mobile Phase wurde sterilfiltrierte
Schwefelsäure (6 mM) verwendet . Es wurden jeweils 50 ~t1 Standard oder Probe injiziert . Die
Laufzeit der Probe betrug 10 min (150-mm-Säule) bzw . 20 min (300-mm-Säule) . Die Tot-
Volumenzeit (Injektionspeak) lag bei etwa 3 min (150-mm-Säule) bzw . bei etwa 6 min (300-
mm-Säule) . Die Detektion erfolgte im UV-Bereich bei 215 nm . Die Auswertung erfolgte mit
der Multi-HSM-Manager 4 .0 Software (Merck Hitachi) . Die Zuordnung der organischen
Säuren erfolgte durch Vergleich der Retentionszeit (vgl . Tab . 7) mit der des jeweiligen
Standards . Die Berechnung der Konzentration erfolgte anhand der Peakfläche durch