Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

MATERIAL UND METHODEN 25
("phänotypische Expression") . Anschließend wurden Aliquots auf LB-Platten mit geeignetem
Antibiotikum ausplattiert und die Platten ÜN bei 37°C inkubiert.
6 .7 Amplifikation von DNA-Fragmenten durch Polymerasekettenreaktion (PCR)
6 .7 .1 Standard-PCR
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde zur in vitro-Amplifizierung von DNA-
Fragmenten (Mullis & Faloona, 1987), zur Kontrolle von Transformanden, Insertions- sowie
Deletionsmutanten eingesetzt . Die PCR wurde in einem Thermo-Cycler (Primus 25, MWG
Biotech, Ebersberg) durchgeführt . Die Konzentration der eingesetzten Komponenten richtete
sich nach den jeweiligen Versuchsbedingungen . Als Anlagerungs-Temperatur wurde eine
Temperatur gewählt, die in der Regel 3 - 7°C unter dem niedrigsten TM-Wert der
Oligonukleotide lag . Der TM-Wert wurde durch die Nukleotid-Zusammensetzung der
eingesetzten Oligonukleotide nach folgender Formel bestimmt: TM = 4 x (nG + nc) + 2 x (nA +
n T ) . Dabei wurden nur die Nukleotide der Primer in die Berechnung einbezogen, die bereits
im ersten Zyklus mit der Matrizen-DNA hybridisierten . Der Zeitraum für die DNA-
Neusynthese wurde je nach Größe des zu amplifizierenden Fragments variiert, wobei
routinemäßig 1 min pro 1000 Basen berechnet wurde . Alle als Primer eingesetzten
Oligonukleotide sind in Tab . 3 aufgeführt . Für analytische PCR wurde Taq-DNA-Polymerase
(Qiagen, Hilden oder Sigma, Deisendorf) eingesetzt. Zur Amplifizierung von DNA-
Fragmenten, die für weitere Klonierungsschritte verwendet wurden, wurde der Expand High
Fidelity Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) genutzt, der durch die Kombination von Taq-
DNA-Polymerase mit einer 3'-5'-fehlerkorrigierenden Pwo-DNA-Polymerase eine geringere
Fehlerrate bewirkt (Fehlerrate von 5 x 10 -6 für Pwo und 1 x 10-5 für die Taq-Polymerase ;
Barnes, 1994) .
Standard-PCR-Ansatz :
DNA-Matrize
dNTP-Mix
Primer-for
Primer-rev
10 x Puffer
ddH20
Taq-Polymerase
0,5-1 lag
je 200 ~tM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
25 pmol (Endkonzentration 0,5 ~tM)
25 pmol (Endkonzentration 0,5 ~tM)
5 ~t 1
ad 50 ~tl
1 ~t l (5 U)