Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

20 MATERIAL UNDMETHODEN
6 .1 .2 Isolierung chromosomaler DNA
Die Isolierung und Reinigung von chromosomaler DNA aus E. coli erfolgte im kleinen
Maßstab (ausgehend von 5 ml Übernachtkultur) nach folgendem Protokoll (Ausubel et al.,
1992) : Abzentrifugierte Zellen aus 1,5 ml ÜN-Kultur wurden in 567 ~t1 TE-Puffer
resuspendiert und mit 30 ~t1 SDS (10 %, w/v) sowie 3 ~t1 Proteinase K (20 mg/ml) versetzt
und 1 h bei 37°C inkubiert . Anschließend wurden 100 ~tl einer 5 M NaCI-Lösung und 80-~tl-
CTAB/NaCI-Lösung (auf 60°C erwärmt, 10 % (w/v) CTAB, 0,7 M NaCI) hinzugefügt und
10 min bei 65°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Phenol/Chloroform-Extraktion der
genomischen DNA . Dazu wurde die Lösung mit 1 Volumen Phenol-Chloroform-
Isoamylalkohol (25:24 :1 Volumenanteile, Roth) versetzt, 30 sec gemischt und abzentrifugiert
(5 min, 13000 g) . Der Überstand wurde nochmals mit 1 Volumen Phenol-Chloroform-
Isoamylalkohol extrahiert . Nach Zentrifugation (5 min, 13000 g) wurde die obere wässrige
DNA-haltige Phase abgenommen und die DNA durch Zugabe von 0,6 Volumen Isopropanol
gefällt und abzentrifugiert (2 min, 13000 g) . Das Pellet wurde mit 1 ml 70 % (v/v) Ethanol
gewaschen, getrocknet und in 100 ~tl H2O resuspendiert . Die DNA-Konzentration wurde wie
unter 6 .4 beschrieben bestimmt .
6 .1 .3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit dem QIAEX II Gel
Extraction Kit (Qiagen, Hilden) nach dem Protokoll des Herstellers .
6 .2 Reinigung von DNA
Die Reinigung oder/und Aufkonzentrierung von DNA erfolgte durch Ethanolfällung . Hierzu
wurde die DNA-Lösung mit 1 /1o Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 3 Volumina
Ethanol gemischt . Anschließend wurde die DNA durch Zentrifugation (30 min, 15000 g, 4°C)
sedimentiert, mit eiskaltem 70 %-igem (v/v) Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in TE-
Puffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,5, 1 mM EDTA) oder Wasser gelöst.
PCR-Produkte, die direkt für die Restriktion bestimmt waren, wurden mit dem PCR
Purification-Kit nach den Angaben des Herstellers (Qiagen) gereinigt, um Oligonukleotide
und noch vorhandene Nukleotide zu entfernen . Die DNA wurde mit TE-Puffer oder Wasser
eluiert .