Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

ERGEBNISSE 69
6 .4 Suche nach dem Gen für den Pyruvat-Importer
Wie bei den Experimenten zur Untersuchung des Einflusses der Pyruvat-Konzentration auf
das Wachstum von MG1655 beschrieben wurde, ist eine Ursache für die bei
Fermentationsexperimenten beschriebene Produktionsgrenze von circa 700 mM Pyruvat
sowohl durch osmotischen als auch durch einen pyruvatspezifischen Stress bedingt . Eine
weitere Ursache für diese Produktionsgrenze kann sein, dass exportiertes Pyruvat wieder in
die Zelle transportiert wird . Wie bereits beschrieben, wurde der Pyruvat-Importer in E. coli
bisher jedoch nur biochemisch charakterisiert (Lang et al ., 1987) . Einen eventuell vorhanden
"futile cycle" könnte man durch die Deletion eines bisher nicht identifizierten Gens für einen
Pyruvat-Importer unterbinden und dadurch eventuell die Pyruvat-Produktion erhöhen . Die
Identifizierung des entsprechenden Gens sollte durch Selektion von Transposon-Mutanten
erfolgen, die in Gegenwart von Bromopyruvat oder Fluoropyruvat wachsen können . Beide
Substanzen wirken in geeigneten Konzentrationen toxisch, z.B . durch Hemmung des Pyruvat-
Dehydrogenase-Komplexes (Flournoy & Frey, 1989 ; Lowe & Perham, 1984) . Bei der
Analyse des Pyruvat-Imports war gezeigt worden, dass Bromopyruvat und Fluoropyruvat den
Pyruvat-Transport inhibieren . Das deutet darauf hin, dass der Transporter auch Bromopyruvat
und Fluoropyruvat als Substrate erkennt. Wenn das entsprechende Transportergen durch ein
Transposon inaktiviert würde, sollte dies zu einer Resistenz gegenüber Bromopyruvat und
Fluoropyruvat führen, vorausgesetzt, es gibt tatsächlich nur ein Transportsystem für diese
Verbindungen . Mit Hilfe dieses Selektionssystem konnte vor kurzem auch das JEN1-Gen für
den Pyruvat-Transporter von Saccharomyces cerevisiae identifiziert werden (Akita et al.,
2000) .
Zunächst wurden Wachstumsversuche mit E. coli MG1655 in Flüssigkultur mit Glucose-
Minimalmedium und unterschiedlichen Konzentrationen von Fluoropyruvat durchgeführt .
Das Wachstum von MG1655 war bei Zusatz von 4 mM Fluoropyruvat halbmaximal (Abb .
23) . Bei Zusatz von 100 mM war kein Wachstum mehr zu beobachten . Auf Glucose-
Minimalmedium-Platten war das Wachstum mit 50 mM Fluoropyruvat leicht inhibiert, mit
100 mM vollständig . Im Fall von Bromopyruvat war das Wachstum in Glucose-
Minimalmedium bereits bei 0,4 mM zu 50 % gehemmt und bei 10 mM gab es kein Wachstum
mehr (Abb . 23) . Auf Glucose-Minimalmedium-Platten mit 0, 0,5, 1, 5, 10 bzw . 20 mM
Bromopyruvat war ab einer Konzentration von 5 mM kein Wachstum mehr zu beobachten .